انتقال عامل نسخه برداري WDREB2 به گندم با استفاده از آگروباکتريوم براي بهبود مقاومت به تنش هاي غيرزنده : پایان نامه ارشد کشاورزی بیوتکنولوژی

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” انتقال عامل نسخه برداري WDREB2 به گندم با استفاده از آگروباکتريوم براي بهبود مقاومت به تنش هاي غيرزنده ” با گرایش بیوتکنولوژی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده انتقال عامل نسخه برداري WDREB2 به گندم با استفاده از آگروباکتريوم براي بهبود مقاومت به تنش هاي غيرزنده :

در سال هاي اخير ظهور تکنيک هاي جديد مهندسي ژنتيک به عنوان ابزاري جديد در تحقيقات کشاورزي همسو با اصلاح سنتي در توسعه روش هاي جديد براي دستورزي هاي ژنتيکي گياهان نقش بسيار مهمي ايفا کرده است. بنابراين بيوتکنولوژي اين پتانسيل را دارد که با توليد گياهان با خصوصيات بهبود يافته مکمل روش هاي سنتي اصلاح گياهان شود. با توجه به نقش گياهان زراعي و بخصوص گندم در تامين غذاي مردم دنيا اين گياهان اهداف مناسبي جهت مطالعه و دستورزي هاي ژنتيکي مي باشند. تنش هاي محيطي غير زنده از قبيل خشکي، سرما، شوري اثرات مضري بر رشد و عملکرد گياهان دارند و مقاومت به آنها از جمله اهداف اصلي اصلاح کنندگان گياهان بوده است. بهبود مقاومت به تنش ها با استفاده از انتقال يک ژن تنظيمي مانند عوامل رونويسي که در مسير هاي تنظيمي متعددي دخالت دارند، امکان پذير است.

گزارشات و تحقيقات انجام شده تاکنون حاکي از موفقيت در بهبود مقاومت به تنش هاي غير زنده با استفاده از عوامل تنظيمي بوده است. عوامل رو نويسي DREB عضوي از خانواده AP2/ERF هستند. اين خانواده گروه مهمي از عوامل رونويسي را شامل مي شود که در پاسخ به تنش هاي غير زيستي نقش بسزايي دارند. بررسي ناحيه پروموتري ژن هاي درگير درپاسخ به تنش هاي آبي و دماهاي پايين و غير وابسته به ABA منجر به کشف يک ناحيه ٩ جفت بازي با توالي TACCGACAT شده که آن را DRE ناميده اند. DRE شامل يک توالي مرکزي محافظت شده ۵ جفت بازي به صورتCCGAC است که آن را توالي تکراري C مي نامند. پروتئين هاي کد شده توسط ژن هاي DREB به اين توالي متصل و منجر به تنظيم بيان ژن ها مي شود.

عوامل رونويسي متعددي در غلات از جمله گندم ، برنج ، ذرت و جو شناسايي شده است که به موتيف CRT/DRE متصل مي شوند. ژن WDREB2يا TaDREB از نظر توالي همولوژي بالايي با ژن DREB2 در آرابيدوپسيس داشته و بيان آن تحت تاثير تنش خشکي ، سرما ، اسيد آبسيزيک و شوري القا مي شود. با استفاده از روش انتقال ژن مبتني بر آگروباکتريوم، اين ژن به گندم انتقال داده شد که آناليز مولکولي با استفاده از PCR تراريخت بودن گياهان بدست آمده راتاييد مي کند و همچنين بررسي بيان ژن با استفاده از تکنيک Real Time PCR نشان داد که برخي از گياهان تراريخت به ميزان 24 برابر نسبت به گياه غير تراريخت افزايش بيان داشته اند.

مقدمه

فنون هاي سنتي بهنژادي گياهان شامل تلاقيهاي مختلف و انتخاب بوده و فنون هاي درون شيشه اي مکمل اين روش ها در ايجاد گياهان با صفات مطلوب ميباشند. در سالهاي اخير ظهور فنون هاي جديد مهندسي ژنتيک به عنوان ابزاري جديد در تحقيقات کشاورزي همسو با به نژادي سنتي در گسترش روشهاي جديد براي دستورزيهاي ژنتيکي گياهان نقش بسيار مهمي ايفا کرده است. يکي از شاخه هاي زيست فناوري گياهي، انتقال ژن هاي خاص به سلولهاي گياهي و باززايي گياه از اين سلول ها با استفاده از روش هاي کشت بافت گياهي مي باشد. بنابراين زيست فناوري اين پتانسيل را دارد که با توليد گياهان با خصوصيات بهبود يافته مکمل روشهاي سنتي بهنژادي گياهان شود. بر خلاف روشهاي به نژادي سنتي که در آن ها دستهاي از ژن ها منتقل مي شود، در روشهاي مبتني بر زيست فناوري ميتوان يک ژن مشخص را از هر موجودي انتخاب و به جاندار ديگر انتقال داد. با توجه به نقش گياهان زراعي و بخصوص گندم در تامين غذاي مردم دنيا اين گياهان اهداف مناسبي جهت مطالعه و دستورزيهاي ژنتيکي ميباشند.

جمعيت جهان به گونه اي روز افزوني در حال افزايش است. اين جمعيت كه در سال 1930 ميلادي تنها 2 ميليارد نفر بود، در سال 1990 به 3/5 ميليارد نفر رسيد و در سال 2000 ميلادي از 6 ميليارد نفر تجاوز كرد (امام، 1386) و پيش بيني مي شود كه جمعيت دنيا تا سال 2025 به 8 ميليارد نفر برسد ( FAO, 2006).

بيشتر مدل ها پيش بيني كرده اند كه كمبود جدي مواد غذايي به ويژه در مناطق خشك و نيمه خشك جهان تشديد خواهد شد. پيش‌‌بيني شده است كه جمعيت ايران بر مبناي نرخ رشد 2 درصد، در سال 1400 از120 ميليون نفر تجاوز كند (امام، 1386). تقاضا براي مصرف مواد غذايي در كشور هاي كمتر گسترش يافته از سال 1980 تا 2030 حدود 7/2 برابر خواهد شد (FAO, 2006). بنابراين، بحران غذايي از مسايلي است كه انسان امروزي با آن روبرو خواهد.

غلات مهمترين گياهان غذايي كره‌ي زمين و تأمين كننده‌ي 70 درصد غذاي مردم كره‌ي زمين مي‌‌باشند. گندم و برنج (Oryza sativa) روي هم تقريباً 60 درصد انرژي مورد نياز بشر را تأمين مي‌‌كنند به طور كلي بيش از سه چهارم انرژي و يک دوم پروتئين مورد نياز بشر از غلات تأمين مي‌‌شود و به راستي غلات پايه‌ي اصلي تغذيه و بقاي بشر به شمار مي‌‌روند (امام، 1386).

محصول گندم در بسياري از كشورها از جمله ايران، عاملي بسيار مهم براي پايداري سياسي و اقتصادي و همچنين عاملي مهم در بهبود درآمد بيشتر كشاورزان است. در اكثر كشورهاي در حال گسترش، به دليل اهميت غلات در امنيت غذايي جمعيت زياد اين كشورها، دولت تجارت غلات را تحت انحصار خود درمي آورد (صحرائيان و بخشوده، 1386).

گندم (Triticum spp) مهم ترين گياه زراعي دنيا است (Martin et al., 1976) و در مساحت وسيعي از زمين هاي كشاورزي دنيا كشت مي گردد. توانايي سازگاري گندم با اقليم هاي مختلف به حدي است که در سراسر کره زمين قابليت زراعت دارد (Slafer, 1994).

52% زمين هاي قابل کشت جهان به غلات و دو سوم اين ميزان به کشت گندم اختصاص دارد (Slafer, 1994). سابقه کشت گندم به 10 تا 15 هزار سال پيش از ميلاد بر مي گردد (Slafer, 1994; Arnon, 1972)

گندم يکي از ارزشمندترين منابع انرژي براي مردم جهان است که دستورزيهاي ژنتيکي آن جهت افزايش عملکرد و به حداقل رساندن کاهش محصول به علت شرايط نا مناسب محيطي و حمله آفات و بيماريها انجام مي شود. در اوايل دهه 60 بهنژادي سنتي همراه با بهبود مديريت مزرعه منجر به افزايش قابل توجه عملکرد گندم در جهان شد که انقلاب سبز نام گرفت و به دنبال آن دستورزي هاي ژنتيکي گندم به سوي تنش هاي محيطي زيستي و غير زيستي که باعث کاهش محصول ميشوند، تغيير پيدا کرد. با توجه به اين تغيير سياست در دهههاي اخير، زيست فناوري با کاهش هزينه توليد از طريق توليد گياهان مقاوم به تنش هاي زيستي و غيرزيستي و افزايش کيفيت محصول راه حلي مناسب مي باشد.

عوامل رو نويسي DREB[1] عضوي از خانواده AP2/ERF هستند. اين خانواده گروه مهمي از عوامل رونويسي را شامل مي شود که در پاسخ به تنش هاي غير زيستي نقش بسزايي دارند. بررسي ناحيه پروموتري ژن هاي درگير درپاسخ به تنش هاي آبي و دماهاي پايين و غير وابسته بهABA منجر به کشف يک ناحيه ٩ جفت بازي با توالي TACCGACAT شده که آن را DRE ناميده اند (Kasuga et al., 1999). DRE شامل يک توالي مرکزي محافظت شده ۵ جفت بازي به صورت CCGAC است که آن را توالي تکراري C مي نامند. پروتئينهاي کد شده توسط ژن هاي DREB به اين توالي متصل و منجر به تنظيم بيان ژن ها مي شود .( Kasuga et al., 1999) عوامل رونويسي متصل شونده به موتيفCRT/DRE متعددي در غلات از جمله گندم ، برنج ، ذرت و جو شناخته شده است. عامل رونويسي WDREB2ياTaDREB در گندم، يک پروتئين باند شونده به توالي CRT/DRE را کد مي کند. اين ژن از نظر توالي همولوژي بالايي با ژن DREB2در آرابيدوپسيس داشته و بيان آن تحت تاثير تنش خشکي ، سرما ، اسيد آبسيزيک و شوري القا مي شود. القاي بيان اين ژن منجر به بيان ساير ژن هاي پايين دست القا شونده به وسيله اين عامل رونويسي که در مقاومت به تنش هاي غير زيستي موثرند، مي شود (Egawa et al., 2006).

با توجه به اهميت تنش هاي غير زيستي خشکي و سرما و خسارت هاي ناشي از آنها بر گياهان، اين پژوهش با هدف زير انجام شد.

– انتقال ژن WDREB2 به گندم جهت بهبود مقاومت به تنش هاي محيطي غير زيستي

فهرست مطالب


فصل اول: مقدمه					1

فصل دوم: مروري بر پژوهش هاي پيشين					5
	2- 1			گندم	6
	2- 2			به نژادي گندم	7
	2-2-1			زيست فناوري و گندم	8
	2-2-2			کشت بافت گندم	9
	2-2-2-1			انتخاب ريز نمونه	10
	2-3			انتقال ژن به گندم	13
	2-3-1			روش هاي مستقيم	14
	2-3-1-1			بمباران ذره اي	14
	2-3-1-2			الکتروپوريشن	16
	2-3-1-3			روش هاي جايگزين	17
	2-3-2			آگروباکتريوم	17
	2-4			مشکلات انتقال ژن به گياهان تک لپه	23
	2-5			پروموترها	25
	2-5-1			انواع پروموتر	25
	2-5-1-1			پروموترهاي بيان دايم	25
	2-5-1-1-1			پروموترهاي پاتوژن هاي گياهي	26
	2-5-1-1-1-1			پروموتر CaMV 35S	26
	2-5-1-1-1-2			پروموترهاي اوپين	27
	2-5-1-1-2			پروموترهاي تک لپه اي	27
	2-5-1-1-2-1			پروموتر يوبي کوييتين گياهي (Ubi)	27
	2-5-1-1-2-2			پروموتر اکتين1 برنج (Act-1)	29
	2-5-1-1-2-3			پروموتر الکل دهيدروژناز ذرت (Adh-1)	30
	2-5-1-2			پروموترهاي مختص بافت يا مراحل تکاملي	31
	2-5-1-3			پروموترهاي القايي	32
	2- 5-1-3-1			پروموترهاي تنظيمي با الکل	33
	2- 5-1-3-2			پروموترهاي تنظيمي با تتراسايکلين	34
	2- 5-1-3-3			پروموترهاي تنظيمي با استروييد	35
	2- 5-1-3-4			پروموترهاي تنظيمي با فلزات	35
	2- 5-1-3-5			پروموترهاي تنظيمي با پاتوژن ها	36
	2- 5-1-3-6			پروموترهاي القاي فيزيکي	36
	2-5-1-4			پروموترهاي سنتزي	37
	2-6			نشانگر هاي ژنتيکي	37
	2-6-1			نشانگرهاي گزارشگر	38
	2-6-2			نشانگرهاي گزينشگر	40
	2-6-2-1			ژن هاي مقاومت به آنتي بيوتيک	40
	2-6-2-2			ژن هاي مقاومت به علف کش	41
	2-6-2-3			ژن هاي نشانگر متابوليکي	42
	2-7			خاموشي تراژن در گندم	43
	2-8			انتقال صفات با ارزش به گندم	44
	2-8-1			بهبود ارزش غذايي	44
	2-8-2			ايجاد نر غقيمي	45
	2-8-3			مقاومت به تنش هاي زيستي	46
	2-8-4			مقاومت به تنش هاي غيره زيستي	47
	2-9			تنش	47
	2-9-1			مسيرهاي ژن هاي القا شونده توسط تنش هاي غير زيستي	49
	2-9-1-1			مسيرهاي وابسته به اسيد آبسيزيک	51
	2-9-1-1-1			ژن هاي AREB / ABF	51
	2-9-1-1-2			ژنMYB2 وMYC2	51
	2-9-1-1-3			ژنهاي NAC	52
	2-9-1-2			مسيرهاي مستقل از اسيد آبسيزيک	52
	2-9-1-2-1			خانواده عوامل رونويسي AP2/ERF	52
	2-9-1-2-1-1			زير خانواده (AP2) APETALA2	53
	2-9-1-2-1-2			زير خانوادهERF	53
	2-9-1-2-1-3			زير خانواده RAV	54
	2-9-1-2-1-4			زير خانواده DREB	54
	2-10			WDREB2 (TaDREB2	57

فصل سوم: مواد و روش ها					59
	3- 1		آماده کردن ژن WDREB2		60
	3- 2		انتقال پلاسميد به باکتري آگروباکتريوم		60
	3-2-1		استخراج پلاسميد هاي PBI121 داراي ژن WDREB2		60
	3-2-2		تراريزش پلاسميدهاي pBI121 نوتركيب به درون سلولهاي مستعد آگروباکتريوم		62
	3-2-3		انتخاب کلوني هاي نوترکيب		63
	3-2-4		واکنش زنجيره اي پليمراز با پرايمرهاي اختصاصي براي تاييد تک کلون ها		63
	3-2-5		نگهداري باکتري ها در گليسرول و تهيه استوک باکتري		65
	3-3		تراريختي گياهان گندم با واسطه اگروباکتريوم		65
	3-3-1		محيط كشت بافت گياهي		65
	3-3-2		آماده سازي و کشت باکتري اگرو با باکتريوم جهت تلقيح		67
	3-3-3		تلقيح، انتخاب و باززايي گياهان تراريخت		67
	3-3-3-1		انتخاب و ضدعفوني بذر گندم		67
	3-3-3-2		جداسازي جنين ها		68
	3-3-3-3		تلقيح جنينها با باکتري آگروباکتريوم حاوي سازه		68
	3-3-3-4		شستشوي جنين ها با آنتيبيوتيک سفوتاکسيم		69
	3-3-3-5		انتقال به محيط انتخابي، باززايي، ريشهزايي		69
	3-4		تاييد تراريختي		70
	3-4-1		استخراج DNA گياهان تراريخت		70
	3-4-2		واکنش زنجيرهاي پليمراز براي تاييد وجود ژن WDREB2 در گياهان تراريخت		72
	3-4-3		استخراج RNA		72
	3-4-5		سنتز رشته اول cDNA		74
	3-4-6		انجام Real-Time PCR جهت مقايسه ميزان بيان ژن WDREB2 در گياهان تراريخت نسبت گياه شاهد غير تراريخت		76

فصل سوم: نتايج و بحث					78
	4- 1	آماده کردن سازه ژن WDREB2			79
	4- 2	تراريختي اگروباکتريوم			80
	4- 3	تراريختي گياهان گندم با واسطه اگروباکتريوم			81
	4- 4	استخراج DNA گياهان تراريخت			84
	4- 5	واکنش زنجيره اي پليمراز براي تاييد وجود ژن WDREB2 در گياهان تراريخت			85
	4- 6	استخراج RNA و ساخت cDNA			86
	4- 7	انتقال به گلدان			87
	4- 8	بحث			89
	4-8-1	انتقال ژن به گياهان گندم			89
	4-8-2	نتيجه گيري کلي			91
	4-8-3	پيشنهادات			93

فهرست منابع					94
منابع فارسي					94
منابع انگليسي					94

فهرست جداول

	جدول3-1 مواد استفاده شده در هر واکنش PCR و چرخه حرارتي واکنش زنجيره اي پليمراز TaDREB	64
	جدول 3-2 ترکيبات محيط کشت هاي مختلف مورد استفاده در تراريختي گياهان گندم	66
	جدول 3-3 بافر CTAB استفاده شده براي استخراج DNA	70
	جدول 3-4 نوع و ميزان مواد بکار رفته براي تيمار DNase	74
	جدول 3-5 مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA	74
	جدول 3-6 مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتزcDNA	75
	جدول 3-7 مواد به کار رفته در Real-Time PCR ژن WDREB2 و کنترل داخلي	76
	جدول 3-8- سيكل گرمايي استفاده شده در Real-Time PCR ژن WDREB2…...	77
	جدول 3-9- سيكل گرمايي استفاده شده در Real-Time PCR ژن کنترل داخلي……	77

فهرست شکل ها

	شکل2-1 عناصر سيستم تنظيمي يوبي کوييتين در گياهان	28
	شکل 2-2 ژن اکتين برنج و عناصر پروموتري آن	29
	شکل2-3- شبکه هاي تنظيمي بيان ژن هاي القا پذير به وسيله تنش هاي محيطي	50
	شکل4-1 نقشه ناقل سازه WDREB pBI121	79
	شکل 4-2 نقوش الکتروفورزي محصول PCR کلوني هاي نوترکيب اگروباکتريوم داراي سازه pBI+WDREB2	80
	شکل 4-3 جنين هاي جداشده گندم روي محيط MS بدون هورمون	81
	شکل 4-4 نگهداري گياهچه ها در محيط استراحت، قبل از بردن به محيط انتخابي…………	82
	شکل 4-5 سفيد شدن گياهچه در محيط انتخابي بر اثر عامل گزنشگر جنتيسين……………..	83
	شکل 4-6 گياهچه ها در مرحله باززايي	84
	شکل 4-7 نقوش الکتروفورزي DNA استخراج شده برخي از گياهان تراريخت	84
	شکل 4-8 نقوش الکتروفورزي محصول PCR با پرايمر تخصصي ژن WDREB2 ………	85
	شکل4-9 نقوش الکتروفورزي PCR با پرايمرهاي تخصصي ژن WDREB جهت اطمينان از صحت cDNA	86
	شکل4-10 نمودار نشان دهنده تک باند بودن و تخصصي بودن پرايمر	87
	شکل4-11 آزمون Real Tim PCR ژن WDREB	87
	شکل4-12 الگوي بيان ژن در گياهان ترايخت نسبت به گياه غيرتراريخت	88