بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان”بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR ” با گرایش زراعت و اصلاح نباتات و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR:

گیاه بارهنگ با نام علمی(Plantagomajor.L) جزء خانواده Plantaginaceae میباشد.از موسیلاژ این گیاه در فرآوردههای دارویی و آرایشی استفاده میگردد. به منظور بررسی تنوع حاصل از کشت بافت در کالوسهای حاصل از گیاه بارهنگ، 18 تیمار حاصل از کالوسهای القا شده از ریزنمونه های مختلف در غلظتهای متفاوت هورمونی به همراه یک نمونه شاهد انتخاب و DNA ژنومی با استفاده از روش CTAB استخراج و تنوع موجود بین نمونه ها با استفاده 6 پرایمر از نشانگرهای ISSR بررسی شد. بررسی تنوع سوماکلونال حاصل در شرایط مختلف کشت، ریزنمونه ها و واکشتها با استفاده از نشانگرهای ISSR نشان دهنده الگوی نواری متفاوت در بین کالوسهای حاصل از ریزنمونه های مختلف در محیطها و واکشتهای متفاوت بود متوسط تعداد باندهای چند شکل با در نظر گرفتن تمام 59 باند پلیمورف برابر 83/9 باند به ازای هر آغازگر بدست آمد

. تجزیه کلاستر به روش UPGMA و ضریب تشابه دایس با استفاده از نرم‌افزار DARwin انجام شد. دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر انجام شده، ژنوتیپهای مورد بررسی را در 6 گروه طبقه بندی نمود. همچنین مقادیر تشابه ژنتیکی برآورد شده بین افراد بر اساس 59 باند پلیمورف بین مقادیر 27/0 تا 83/0 با متوسط 54/0 بدست آمد.

مقدمه

قدمت شناخت خواص دارویی گیاهان، شاید بیرون از حافظه تاریخ باشد. یکی از دلایل مهم این قدمت، حضور باورهای ریشهدار مردم سرزمینهای مختلف در خصوص استفاده از گیاهان دارویی است. اطلاعات مربوط به اثرها و خواص دارویی گیاهان، از زمانهای بسیار دور به تدریج سینه به سینه منتقل گشته و با آداب و سنن قومی درآمیخته و سرانجام در اختیار نسلهای معاصر قرار گرفته است. طبق برخی «سنگ‌نوشته‌ها» و شواهد دیگر، به نظر میرسد مصریان و چینیان در زمره نخستین اقوام بشری بودهاند که بیش از 27 قرن قبل از میلاد مسیح، از گیاهان به عنوان دارو استفاده کرده و حتی برخی از گیاهان را برای مصرف بیشتر در درمان دردها کشت کردهاند(امیدبیگی، 1386).

گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به عنوان یکی از مهمترین منابع دارویی کاربرد داشتهاند. سازمان بهداشت جهانی تخمینزده است که بیش از 80% از مردم به صورت سنتی و یا مدرن از گیاهان دارویی استفاده میکنند. بعلاوه برخی از داروهای شیمیایی نیز با الگوبرداری از مواد گیاهی ساخته شدهاند (تریپاتی، 2003). اگرچه تقاضا برای این ترکیبات افزایش یافته است اما برخی از این گیاهان، زیستگاههای طبیعی محدود دارند و بسته به شرایط محیطی و جغرافیایی محل رویش گیاه، جمعآوری آنها با مشکلاتی مواجه است. غلظت پایین این ترکیبات در گیاه محدودیت منابع طبیعی، تخریب روزافزون جنگلها و مراتع و فضای سبز، نابودی گونههای متنوع گیاهی و جانوری، مشکلات مرتب با اهلی نمودن و کشت زراعی این گیاهان، توجه محققین را به استفاده از راهکارهای فناوری زیستی جهت افزایش تولید و بهرهوری گیاهان دارویی معطوف نموده است. فناوری زیستی با بهرهگیری از علوم مختلف مانند بیولوژی، بیوشیمی، ژنتیک و … با استفاده از راهکارهای کشت سلولها، اندامها و بافتها، مهندسی ژنتیک و نشانگرهای مولکولی قادر است کارایی گیاهان را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد(کومار، 2008).

کشت سلول، بافتها و اندامهای گیاهی امکان تکثیر انبوه و سریع گیاهان و تولید متابولیتهای ثانویه را در شرایط درون شیشهای (Invitro) فراهم میسازد. با استفاده از این سیستم کشت، علاوه بر دسترسی به منبع اولیه دارو در شرایط کنترل شده و مستقل از محیط، افزایش تولید ترکیبات جدید نیز امکانپذیر می‌گردد(بورگاد، 2002).

تاکنون کشت سلولی طیف وسیعی از گیاهان دارویی بررسی شده است و ترکیبات مهمی نظیر: فلاونوئیدها، تاننها، الکالوئیدها و ترپنوئیدها از این طریق تولید شدهاند(امیدی، 1388).

اهداف مشخص تحقیق بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR:

در این پژوهش اهداف ذیل دنبال میشود:

بررسی و مطالعه وقوع تنوع سوماکلونال در نمونههای حاصل از کشت بافت گیاه بارهنگ با استفاده از نشانگرهای ISSR
بررسی تاثیر نوع ریزنمونه، ترکیبات محیط کشت و تعداد واکشت بر میزان پلیمورفیسم در نمونههای گیاه بارهنگ

نتیجه گیری

شش آغازگر ISSR در مجموع 60 باند واضح و قابل امتیازدهی تولید کردند که از این تعداد 59 باند پلیمورف حاصل گردید. تفاوتهای مشاهده شده در تعداد کل باندهای ISSR و نیز باندهای اختصاصی در بین گیاه شاهد و تیمارهای حاصل از سه واکشت، بیانگر تفاوت ژنتیکی نمونهها است که ناشی از تنوع حاصل از کشت بافت(تنوع سوماکلونال) میباشد. حضور باند اختصاصی در گیاه شاهد و فقدان آن در تیمارهای حاصل از واکشتهای مختلف، نشان دهنده فقدان جایگاه اختصاصی در پروسه کشت بافت است و تفاوتهای مشاهده شده در الگوی ISSR ممکن است ناشی از عوامل مختلف همچون ایجاد جایگاه اتصال جدید پرایمر و یا از بین رفتن جایگاه اتصال آن در اثر وقوع موتاسیونهای نقطهای یا دخالت عناصر ترانسپوزونی باشد. بنابراین میتوان اظهار کرد شرایط کشت بافت باعث القاء تغییرات ژنتیکی متنوعی در نمونههای مختلف شده است. به نظر میرسد که تنوع ژنتیکی القاء شده در نمونهها با گذشت زمان تعداد واکشتها افزایش یافته است چرا که نمونههای حاصل از واکشتها، از ژنوتیپ گیاه شاهد فاصله دارند. گزارشات گاج(2004) نیز حاکی از آنست که میزان تغییرات ژنتیکی در هسته سلول معمولاً با زیاد شدن سن کشت و افزایش تعداد واکشتها بیشتر میشود و میزان و نوع این تغییرات به ترکیبات محیط کشت بویژه تنظیم کننده های رشد بستگی دارد. بررسیهای مولکولی بر روی ژنوم گیاهان مختلف که تنوع سوماکلونال را نشان دادند ثابت کرد که قسمتی از ژنوم گیاه حساس و مستعد به استرس است و میزان وقوع موتاسیون در این قسمت نسبت به بقیه ژنوم بیشتر است.

تنوع سوماکلونال یک فرایند تصادفی است که نه تنها روی ژن و نهایتاً مورفولوژی گیاه اثر می‌گذارد، بلکه باعث تغییر بیان ژن و کنترل آن میشود. با توجه به اینکه تنوع سوماکلونال بیشتر در اثر وقوع انواع جهشها میباشد، بنابراین باید از تکنیکهای ارزیابی مناسبی برای تشخیص انواع جهشها در کشت بافت استفاده شود. نگزاهایو و همکاران(2007)، در مطالعه تنوع سوماکلونال در سطح DNAدر برنج با استفاده از دو مارکر RAPD و ISSR، گزارش نمودند که وقوع تنوع سوماکلونال وابسته به وقوع متیلاسیون عمدتاً در نوکلئوتیدهای سیتوزین میباشد.

لی و همکاران(2006)، در آنالیز گیاهچه های نخل روغنی حاصل از کشت بافت با استفاده از مارکر مولکولی AFLP ، از دو گروه آنزیمهای حساس و غیرحساس به متیلاسیون در مرحله هضم آنزیمی استفاده نمودند. با استفاده از سیستم(MSAP) Methylation- sensetive amplification polimorphism چندشکلی بالائی در استفاده از آنزیمهای حساس به متیلاسیون مانند Hpa П جهت برش آنزیمی نمونههای مختلف نسبت به استفاده از آنزیمهای غیرحساس مانندI Msp و PstI مشاهده گردید. با توجه به نتایج این تحقیق مشخص شد، ایجاد فنوتیپ غیرطبیعی در گیاهان باززا شده در شرایط کشت بافت با ایجاد تغییرات بزرگ در سطح ژنوم پیوستگی ندارد بلکه تغییرات به دلیل بروز متیلاسیون در قسمتهایی از ژنوم میباشد.

فهرست مطالب بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR:

چکیده	1
فصل اول: مقدمه و کلیات	2
1-1- مقدمه	3
1-1-2- گیاهان دارویی	4
1-1-3- گیاهانی که به عنوان گیاه دارویی شناخته می شوند	4
1-1-4- دلایل رویکرد به گیاهان دارویی	5
1-1-5- مواد مؤثره گیاهان دارویی 1-1-5-1- متابولیت های ثانویه	6 7
1-1-5-2- طبقه بندی متابولیت های ثانویه	8
1-1-5-3- تولید متابولیت های ثانویه از گیاهان دارویی	10
1-1-5-4- راهکارهای افزایش متابولیت های ثانویه گیاهی از طریق کشت بافت	10
1-1-6- بیوتکنولوژی و کشت بافت گیاهان دارویی	11
1-1-7- هدف از اصلاح گیاهان دارویی	12
1-2- بارهنگ	14
1-2-1- رده بندی علمی بارهنگ	14
1-2-2- تاریخچه بارهنگ	15
1-2-3- خصوصیات گیاه شناسی بارهنگ	15
1-2-3-1- اختصاصات ظاهری گونه	15
1-2-4- چند گونه از خانواده های بارهنگ	16
1-2-5- محل رویش و پراکندگی طبیعی بارهنگ	17
1-2-6- نیازهای اکولوژیکی بارهنگ	17
1-2-7- ترکیبات بارهنگ	18
1-2-8- خواص درمانی بارهنگ	19
1-3- کاربردهای م هم کشت بافت در اصلاح نباتات	19
1-4- تنوع سوماکلونال	20
1-4-1- تنوع سوماکلونال در کشت بافت گیاهی	20
1-4-2- منشاء و چگونگی ایجاد تنوع سوماکلونال	21
1-4-2-1- تغییرات ژنتیکی(وراثت پذیر	21
1-4-2-1-1- تغییر در سطح پلوئیدی	21
1-4-2-1-2- تغییرات ساختمانی در DNA هسته‌ای	23
1-4-2-1-3- نوترتیبی شیمری	23
1-4-2-2- تغییرات اپیژنتیکی(وراثت ناپذیر	24
1-4-3- کنترل تنوع سوماکلونال	24
1-4-4- کاربرد تنوع سوماکلونال در اصلاح نباتات	26
1-5- مارکر(نشانگر	26
1-5-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی	27
1-5-1-1- نشانگرهای مورفولوژیک	27
1-5-1-2- نشانگرهای مولکولی	27
1-5-1-2-1- نشانگرهای پروتئینی	28
1-5-1-2-2- مارکرهای DNA	28
1-5-1-2-2-1- مارکرهای DNA غیرمبتنی برPCR	29
1-5-1-2-2-2- مارکرهای DNA مبتنی برPCR	30
1-6- دلایل استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینه گیاهان دارویی	32
1-7- اهداف مشخص تحقیق	33
فصل دوم: بررسی منابع	34
2-1- بررسی مرور منابع	35
فصل سوم: مواد و روش‌ها	45
3-1- آزمایش اول	46
3-1-1- مواد گياهي	46
3-1-2- محیط کشت	46
3-1-3- دستورالعمل تهیه یک لیتر محیط کشت MSFull	49
3-1-4-استریل کردن بذور	50
3-1-5- محیط کشت جوانه زنی	50
3-1-6- مرحله کالزایی	50
3-2- آزمایش دوم	51
3-2-1- بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR	51
3-2-2- مواد گیاهی	51
3-2-3- استخراج DNA ژنومی	53
3-2-4- تهیه بافرTE	54
3-2-5- تهیه بافر(5x) TBE	54
3-2-5-1- تهیه بافر(1x) TBE	54
3-2-6- تعیین کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج شده	55
3-2-7- انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR	55
3-2-8- چرخه حرارتی در دستگاهPCR	56
3-2-9- الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز	57
3-2-10- توالی آغازگرهای مورد استفاده	58
3-2-11-تجزیه و تحلیل داده‌ها	59
3-2-11-1-امتیازدهی باندها	59
3-2-11-2- تجزیه خوشه‌ای	59
3-2-11-3- شاخص‌های مولکولی	61
فصل چهارم نتایج و بحث	62
4-1- نتایج مربوط به بررسی الگوی باندی DNA	63
4-2- بررسی محتوای اطلاعات چند شکل (PIC	64
4-3- درجه تشابه ژنتیکی	69
4-4- توزیع فراوانی فاصله ژنتیکی	71
4-5- تجزیه خوشه‌ای	71
4-6- نتایج حاصله از تجزیه به مختصات اصلی(PCO	75
4-7- نتیجه‌گیری	77
4-8- پیشنهادات	79
منابع	80
چکیده انگلیسی	II

فهرست اشکال

شکل 4-1: کالوس ریزنمونه برگ (سمت راست) و ریزنمونه ریشه (سمت چپ)……………..	63
شکل4-2:الگوی باندی 19 تیمار بارهنگ با استفاده از آغازگرهای IS16 (شکل بالا)وIS11 (شکل پایین	67
نمودار 4-3: توزیع فراوانی مقادیر فاصله ژنتیکی بین تیمارهای مورد مطالعه	71
شکل 4-4: دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای با استفاده از ضریب تشابه دایس	74
شکل 4-5: ترسیم بای پلات 19 تیمار مورد بررسی بر اساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم	76

فهرست جداول

جدول 3-1: ترکیبات معدنی محیط پایه MS کامل	46
جدول 3-2: دستور العمل تهیه یک لیتر محیط پایه MS	47
جدول 3-3:اجزاء سازنده استوک عناصر ماکرو	47
جدول 3-4:اجزاء سازنده استوک عناصر میکرو	48
جدول 3-5:اجزاء سازنده استوک عناصر میکروII	48
جدول 3-6: اجزای سازنده استوک آهن	48
جدول 3-7: اجزاء سازنده استوک ویتامین	49
جدول 3-8: ترکیبات هورمونی مورد استفاده در کالزایی	51
جدول 3-9: ریزنمونه های مورد استفاده در فاز کالزایی	51
جدول 3-10: مواد گیاهی مورد استفاده	52
جدول 3-11: اجزاء بافر TE	54
جدول 3-12: اجزاء بافر (5x) TBE	54
جدول3-13: اجزای مورد استفاده برای تهیه 20 میکرولیتر Mastermix	55
جدول 3-14: چرخه حرارتی PCR	56
جدول 3-15: توالی آغازگرهای مورد استفاده	58
جدول 3-16 : وضعیت دو فرد j , i با همدیگر از نظر یک صفت نشانگری	59
جدول 4-17 : نتایج بررسی 19 تیمار گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از نشانگر ISSR……..	66
جدول 4-18: مواد گیاهی مورد استفاده	68
جدول 4-19: ماتریس تشابه بر اساس نشانگر ISSR و ضریب تشابه دایس	70
جدول 4-20: گروه بندی تیمارها بر اساس تجزیه خوشهای 73 راهنمای خرید و دانلود فایل برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید. بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد. در صورت بروز هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد. برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایی