مقایسه و ارزیابی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به سلول‌های یوکاریوتی توسط سازه‌های فاژی لامبدا و M13

سری جدیدی از پایان نامه های رشته زیست شناسی  در گرایش های مختلف آن را برای دانلود کاربران و دانشجویان دانشکده های علوم پایه قرار میدهیم . پایان نامه حاضر با عنوان مقایسه و ارزیابی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به سلول‌های یوکاریوتی توسط سازه‌های فاژی لامبدا و M13 در  رشته ژنتیک   با فرمت ورد (قابل ویرایش)  در 125 صفحه معرفی میگردد.

چکیده تحقیق مقایسه و ارزیابی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به سلول‌های یوکاریوتی توسط سازه‌های فاژی لامبدا و M13

ژن‌درمانی به عنوان روشی نوین برای درمان برخی بیماری‌های ژنتیک و سرطان، جایگاه ویژه‌ای را در عرصه پزشکی به خود اختصاص داده است. با این وجود موفقیت این روش درمانی الزامات گسترده‌ای دارد که ازآن جمله می‌توان به انتقال مؤثر ترانسژن، القاء بیان و کنترل میزان بیان در سلول هدف اشاره کرد. در میان گستره وسیعی از انواع ناقل‌های ژنی ویروسی و غیرویروسی، باکتریوفاژها به علت ویژگی‌های منحصر به فردی که دارند به عنوان حامل‌های ژنی بی‌خطر برای استفاده در بالین معرفی شده‌اند. دانشمندان تا کنون انواع متعددی از تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژ را طراحی نموده‌اند. در این میان دو فاژλ و M13 کارآیی به نسبت خوبی را در انتقال ژن از خود نشان داده‌اند. آنچه که در رابطه با این دو ناقل فاژی حائز اهیمت می‌باشد این است که سازه‌های فاژی مبتنی بر فاژهای λ و M13 به دلیل ساختار ژنومی متفاوتی که دارند انتظار می‌رود که کارآیی متفاوتی نیز در انتقال و بیان ترانسژن از خود نشان دهند.

در این مطالعه ناقل‌های ژنیλ-ZAP-CMV و  pCMV Script حاوی ژن GFP به ترتیب به عنوان سازه‌های ژنی مبتنی بر فاژهای λ و M13 مورد استفاده قرار گرفتند. ابتدا ذرات فاژی -GFP λ  تکثیر شده و سپس از ذرات فاژی مذکور با روش برش و خارج‌سازی درون سلولی (In Vivo Excision) با کاربرد فاژ کمکی R408 ذرات فاژی M13-GFP تهیه شدند. ذرات فاژی حاصل پس از تأیید و تکثیر برای آلوده‌سازی سلول‌های AGS مورد استفاده قرار گرفتند و جهت تأیید ورود ذرات فاژی، سلول‌های تیمار شده توسط میکروسکوپ فلورسانس و نیز واکنش PCR مورد بررسی قرار گرفتند.

در گام بعدی برای به دست آوردن سازه‌های فاژیλ-ZAP-CMV-GFP و نیز pCMV Script GFP، به ترتیب DNA ژنومی مربوط به ذرات فاژی -GFP λ و نیز M13-GFP تکثیر شده، استخراج و برای آلوده‌سازی سلول‌های AGS مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت کارآیی انتقال و بیان ژن GFP در سلول‌های AGS توسط دستگاه FACS مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی میکروسکوپی سلول‌های تیمار شده با ذرات فاژی M13-GFP و نیز نتایج واکنش PCR نشان می‌دهد که درصد کمی از سلول‌های AGS ذرات فاژی مذکور را دریافت نموده‌اند.

هم‌چنین بررسی سلول‌های AGS با دستگاه FACS نشان می‌دهد که آن دسته از سلول‌هایی که سازه‌های فاژی-GFP λ-ZAP-CMV را دریافت نموده‌اند در مقایسه با سلول‌هایی که سازه ژنی pCMV Script GFP را دریافت نموده‌اند، نه تنها تعداد سلول‌های GFP مثبت بیشتری نشان می دهند بلکه شدت بیان ژن GFP نیز بیشتر می‌باشد. این نتایج می‌تواند مؤید این مطلب باشد که ناقل‌های ژنی مبتنی بر ذرات فاژی لامبدا به علت ساختار ژنومی DNA دورشته‌ای که دارند، نسبت به تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژ M13 کارآیی بیشتری را در انتقال و بیان ترانسژن از خود نشان می‌دهند.

فهرست مطالب

1-1 مقدمه             2

1-2 ناقل‌های مورد استفاده در ژن‌درمانی.. 4

1-2-1 ناقل‌های ژنی ویروسی    4

1-2-2 ناقل‌های ژنی غیر ویروسی   6

1-2-3 باکتریوفاژها                7

1-3 باکتریوفاژ لامبدا 12

1-3-1 بیولوژی باکتریوفاژ لامبدا 12

1-3-2 ساختار فاژ لامبدا          13

1-3-3 سازماندهی ژنوم فاژ لامبدا 14

1-3-4 چرخه زندگی فاژ لامبدا 15

1-3-5 فاژ لامبدا به عنوان ناقل ژنی   18

1-4 باکتریوفاژ M13  22

1-4-1 بیولوژی باکتریوفاژ M13      22

1-4-2 ساختار باکتریوفاژ M13   22

1-4-3 سازماندهی ژنومی باکتریوفاژ M13  24

1-4-4 چرخه زندگی باکتریوفاژ M13  25

1-4-5 فاژ M13 به عنوان ناقل ژنی   27

1-5 اهمیت و اهداف پژوهش…. 31

2-1 روش تهیه محلول‌ها و بافرها 31

2-1-1 تهیه محلول 1 مولار تریس     31

2-1-2 تهیه کلرید کلسیم 50 میلی‌مولار  31

2-1-3 تهیه محلول EDTA 0.5 M  PH=8. 32

2-1-4 تهیه SDS10%           32

2-1-5 تهیه بافر TE                32

2-1-6 تهیه TBE 10X           33

2-1-7 تهیه ژل آگارز %1         33

2-1-8 تهیه بافر SM               34

2-1-9 تهیه PBS                           34

2-1-10 تهیه تریپسین- EDTA 0.25%   35

2-1-11 تهیه پارافرمالدهید % 4   35

2-1-12 تهیه محلول سدیم آزید %01/0   36

2-2 تهیه محیط‌های کشت… 36

2-2-1 محیط کشت باکتری LB مایع   36

2-2-2 محیط کشت LB مایع همراه با مکمل   37

2-2-3 محیط کشت LB جامد      37

2-2-4 تهیه محیط کشت NZY Agar: 38

2-2-5 تهیه محیط NZY Top Agar: 38

2-2-6 تهیه محیط 2x YT      39

2-3 ناقل‌های مورد استفاده در پژوهش…. 40

2-3-1 ناقل‌‌های فاژی Lambda ZAP®-CMV XR و pCMV Script Ex. 40

2-4 باکتری‌های مورد استفاده در پژوهش…. 42

2-4-1 باکتری E.coli  سویه XL1-Blue MRF´. 42

2-4-2 باکتری E.coli سویه XLOLR   42

2-5 کار با رده‌های سلولی.. 43

2-5-1 ساخت محیط کشت      43

2-5-2 افزودن سرم و تهیه محیط کشت کامل   43

2-5-3 انجماد رده‌های سلولی       44

2-6 مراحل انجام پژوهش به صورت گام به گام. 45

2-6-1 کار با باکتریوفاژ لامبدا       45

2-6-2 کار با باکتریوفاژ M13     52

2-6-3 کشت و پاساژ رده‌ی سلول AGS  58

2-6-4 ترانسفکشن سلول‌های AGS توسط ذرات فاژی M13-GFP  59

2-6-5 استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز سازه ژنی pCMV Script GFP. 62

2-6-6 محاسبه تعداد نسخه‌های سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP. 65

2-6-7 ترانسفکشن سلول‌های AGS توسط سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP. 67

2-6-8 بررسی ورود سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP به رده سلولی AGS  69

3-1 تأیید سازه ژنی λ-ZAP-CMV-GFP و ذرات فاژی λ-GFP. 71

3-2 تکثیر ذرات فاژی λ-GFP و تعیین تیتر آن.. 72

3-3 ساخت ذرات فاژی M13 حاوی توالی GFP. 73

3-3-1 تأیید کلونی‌های حاوی سازه ژنی pCMV Script GFP. 74

3-3-2 تکثیر ذرات فاژی M13-GFP  75

3-3-3 انتقال و بیان ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP  76

3-3-4 بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS  77

3-3-5 استخراج ssDNA از ذرات فاژی M13-GFP  78

3-3-1 استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز ناقل M13-GFP  79

3-4 استخراج λ-DNA   80

3-5 محاسبه تعداد نسخه‌های سازه‌های ژنی  λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP. 81

3-6 ترانسفکشن سلول‌‌های AGS توسط سازه‌های استخراج شده از ذرات فاژی M13-GFP و. 82

3-6-1 بررسی بیان ژن GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس     82

3-6-2 بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP توسط دستگاه فلوسیتومتری   84

3-6-3 بررسی شدت بیان ژن GFP در سلول‌های AGS  86

4-1 تهیه ذرات M13-GFP و بررسی کارآیی ترانسفکشن سلول های AGS توسط آنها 89

4-1-1 بررسی انتقال و بیان ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP  89

4-1-2 بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS  90

4-2 بررسی کارآیی انتقال و بیان ترانسژن توسط سازه‌های λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP. 92

4-2-1 بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس     92

4-2-2 بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به کمک تکنیک فلوسیتومتری   93

4-3 نتیجه‌گیری      100

4-4 پیشنهادات      100

فهرست منابع ………………….102

 فهرست جداول و اشکال

شکل 1‑1: نمایی از فاژ لامبدا 14

شکل 1-2. سازماندهی ژنوم فاژ لامبدا………………………………………………………………………………………………………15

شکل 1-3. چرخه زندگی فاژ لامبدا………………………………………………………………………………………………………….17

شکل 1-4. نمایی از فاژ M13 …………………………………………………………………………………………………………………..24

شکل 1-5. سازماندهی ژنومی فاژ M13……………………………………………………………………………………………………25

شکل1-6. چرخه زندگی فاژ M13…………………………………………………………………………………………………………….27

شکل 2-1. نقشه ژنی ناقل Lambda-ZAP CMV XR…………………………………………………………………………..40

شکل 2-2. نقشه سازه ژنی pCMV Script EX  و توالی نواحی کلونینگ آن……………………………………….41

شکل 3-1. تأیید سازه ژنی λ-ZAP-CMV-GFP و ذرات فاژی λ-GFP………………………………………………..71

شکل 3-2. تکثیر ذرات فاژی λ-GFP و تعیین تیتر آن……………………………………………………………………………72

شکل 3-3. نتایج برش و خارج‌سازی درون سلولی ذرات فاژی M13-GFP…………………………………………….73

شکل 3-4. تأیید کلونی‌های حاوی ذرات فاژمیدی M13-GFP……………………………………………………………..74

شکل 3-5. تکثیر ذرات فاژی M13-GFP و تعیین تیتر آن …………………………………………………………………..75

شکل 3-6. بررسی انتقال ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP…………………………………………………………76

شکل 3-7. بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS……………………………………………………..77

شکل 3-8. استخراج سازه ژنی pCMV Script GFP از ذرات فاژی M13-GFP………………………………..78

شکل 3-9. استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز (RF)………………………………………………………………………..79

شکل 3-10. استخراج سازه ژنی λ-ZAP-CMV-GFP از ذرات فاژی λ-GFP …………………………………….80

شکل 3-11. بررسی بیان ژن GFP منتقل شده توسط سازه‌های ژنی مبتنی بر فاژ………………………………83

شکل 3-12.بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP منتقل شده توسط سازه‌های فاژی…………………………85

شکل 3-13. شدت سیگنال‌های فلورسانس سلول‌های GFP مثبت……………………………………………………….87

جدول 2-1. دستورالعمل ترانسفکشن سلولی با لیپوفکتامین 2000………………………………………………………..68

راهنمای خرید و دانلود فایل

برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.

بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.

در صورت بروز  هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما  پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا مشکل مورد بررسی قرار گیرد. دیجی لود متعهد میشود که هر طور شده فایل خریداری شده ، به دست شما خواهد رسید.

برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود  کلیک نمایید.