وضعيت تنوع ژنتیکی جدایه های ویروس ایکس سیب زمینی از استان همدان : پایان نامه ارشد کشاورزی
کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” وضعيت تنوع ژنتیکی جدایه های ویروس ایکس سیب زمینی از استان همدان ” با گرایش بیماری شناسی گیاهی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.
چکیده وضعيت تنوع ژنتیکی جدایه های ویروس ایکس سیب زمینی از استان همدان:
ویروس ایکس سیبزمینی (Potato virus X- PVX) گونه شاخص جنس Potexvirus از خانواده Alfaflexiviridae میباشد. طی سال های 1389 و 1390، از مناطق کشت اصلی سیب زمینی در استان همدان بازدید و نمونه برداری انجام گرفت. مجموعاً 456 نمونه برگی (تعداد 132 و 324 نمونه بترتیب علائمدار و تصادفی) از 9 مزرعه واقع در مناطق بهار، کبودرآهنگ و رزن جمع آوری گردید. نتایج آزمون الایزا با استفاده از آنتی بادی اختصاصی (بیوربا-سویس) نشان دهنده آلودگی 42 نمونه با ویروس ایکس سیب زمینی بود. بر اساس آزمون الایزا میزان وقوع آلودگی به این ویروس به ترتیب کاهش در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ تعیین گردید.
برای تایید نتایج حاصل از آزمون سرولوژیکی از روش های بیولوژیکی و مولکولی استفاده شد. مطالعه دامنه میزبانی جدایه های ایرانی ویروس ایکس سیب زمینی با استفاده از گیاهان محک مختلف، تفاوتی نشان داد. همچنین در این تحقیق ناحیه ژن پروتئین پوششی ویروس بطول حدود 750 جفت باز با استفاده از آغازگر های اختصاصی تکثیر گردید. آنالیز تبارزایی با استفاده از توالی کامل پروتئین پوششی دو جدایه ویروس شامل Iran H1 و Iran H2 با توالي‌های مربوط به جدايه های خارجی PVX موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های ایرانی در گروه اروپا-آسیا (Eurasia) قرار می گیرند.
در درخت تبارزایی جدایه های تعیین توالی شده در این بررسی با جدایه ویروس ایکس جدا شده از نخود (Pisum sativum) در یک شاخه مستقل و نزدیک بهم قرار گرفتند. طول کامل توالی پروتئین پوششی 714 نوکلئوتید بود که پروتئینی با 237 اسیدآمینه تولید می نماید. این نتایج با نتایج بدست آمده در مورد سایر جدایه های این ویروس از مناطق دیگر دنیا مطابقت دارد. هر چند که جدایه های ایرانی مورد مطالعه در گروه اروپا-آسیا قرار می گیرند ولی هنوز مشخص نیست که آنها جدایه های غالب این ویروس در ایران باشند. برای این منظور لازم است تا جدایه های بیشتری از این ویروس از مناطق خاورمیانه و سایر کشورها تعیین توالی شوند. هر چند بر اساس مطالعات ما این اولین گزارش از آنالیز تبارزایی این ویروس جدا شده از سیب زمینی از ایران واقع در منطقه mid-Eurasia می باشد.
مقدمه:
در بين گياهان دو لپه، سيب زميني مهمترين محصول زراعي است که، پس از گندم، برنج و ذرت در رتبه چهارم جهانی قرار دارد (FAO, 2009). تولید سیب زمینی در جهان طبق گزارشات سازمان خواروبار و کشاورزی ملل متحد (فائو) در سال 2009، معادل 314 میلیون تن بوده است (FAO, 2009).
طبق گزارشات فائو چین بالاترین رکورد تولید سیب زمینی را در سال 2009 در جهان داشته است و بعد از آن به ترتیب روسیه و هند در مقامهای دوم و سوم و آمریکا در مقام چهارم قرار گرفته اند و ایران از نظر تولید سیب زمینی در مقام چهاردهم جهان و دوم خاورمیانه قرار می گیرد (FAO, 2009). تولید سیب زمینی در کشور ما از اهمیت خاصی برخوردار است و فائو تولید سیب زمینی ایران را در سال 2009 میلادی چهار میلیون و 107 هزار و 626 تن اعلام کرده است. استان همدان با 63/16درصد اراضی تحت کشت سیبزمینی کشور، در مقام نخست قرار دارد. میزان تولید سیب زمینی در این استان حدود نیم میلیون تن برآورد شده است (آمارنامه جهاد کشاورزی، 1388).
بر اساس اعلام فائو سطح زیر کشت سیبزمینی در ایران در سال 2009 میلادی نسبت به سال 2008 با کاهش 2/13 درصدی به 153 هزار و 995 هکتار رسید (FAO ,2009).
بیماریهای ویروسی نقش مهمی در کاهش عملکرد سیب زمینی دارند. در این بین ویروس ایکس سیبزمینی (Potato virus X– PVX) موجب کاهش محصول سیبزمینی از 10 تا 20 درصد میگردد، این موضوع نشان دهنده گسترش بیماریهای ویروسی در مزارع سیبزمینی کشور و لزوم تدوین برنامه هایی برای مدیریت آنها میباشد. اولین گام در تدوین چنین برنامه هایی، داشتن اطلاعات کافی از وضعیت (فراوانی و پراکنش) آلودگی ویروسی و شناخت خصوصیات جدایه های غالب ویروسی در هر منطقه میباشد. با توجه به اهمیت زراعت سیب زمینی در استان همدان و از طرفی با در نظر گرفت این نکته که در مورد وضعیت بیماری ویروسی PVX از نظر فراوانی و پراکنش آن در مزارع سیبزمینی این استان و نیز خصوصیات این جدایه ها، اطلاعات دقیقی در دسترس نمیباشد، لذا تحقیق در این مورد به عنوان پایان نامه کارشناسی ارشد در نظر گرفته شد تا در قالب یک پژوهش مدون فراوانی و پراکنش ویروس PVX در مزارع سیب زمینی استان همدان و نیز خصوصیات آنها مطالعه شود. این اطلاعات در تدوین برنامه های مدیریت این بیماری از پیش نیازهای اصلی محسوب میگردد.
فهرست مطالب | ||
| چکیده | 1 | |
| مقدمه | 2 | |
| فصل اول: مروری بر تحقیقات گذشته | ||
| 1- گیاهشناسی سیب زمینی | 4 | |
| 1-1) برگ | 4 | |
| 1-2) ساقه | 4 | |
| 1-3) غده | 5 | |
| 1-4) جوانه | 5 | |
| 1-5) ریشه | 5 | |
| 1-6) گل | 5 | |
| 2- ارقام سیب زمینی | 5 | |
| 2-1) رقم‌هاى خيلى زودرس و زودرس | 5 | |
| 2-2) رقم‌هاى متوسط رس يا ميان‌رس | 6 | |
| 2-3) رقم‌هاى ديررس | 6 | |
| 3- تاریخچه | 7 | |
| 4- مواد موجود در سیب زمینی | 8 | |
| 5- مراحل کشت سیب زمینی | 8 | |
| 5-1) آماده كردن زمين براي كاشت سيب زميني | 8 | |
| 5-2) آماده‌کردن غده‌ها براى کاشت سيب زمينی | 9 | |
| 5-3) کاشتن غده‌ها | 10 | |
| 5-4) آبياري سيب زميني | 11 | |
| 5-5) كوددهي سيب زميني | 11 | |
| 5 -6) وجين كردن و خاك دادن سيب زميني | 12 | |
| 5-7) برداشت | 13 | |
| 6- مراحل پس از برداشت و فرآوري سيب زمينی | 14 | |
| 7- اهمیت اقتصادی سیب زمینی | 15 | |
| 8- ويروسهاي بيماريزاي سيب زميني | 17 | |
| 9- ويروس ايكس سيب زميني Potato virus X | 20 | |
| 9-1) آرايه بندي | 20 | |
| 9-2) علائم | 21 | |
| 9-3) دامنه ميزباني طبيعي ویروس ایکس سیب زمینی | 22 | |
| 9-4) گونه های میزبانی بكار رفته جهت تشخيص PVX | 23 | |
| 9-5) انتقال و انتشار ويروس | 23 | |
| 9-6) پراکنش جغرافیایی | 24 | |
| 9-7) خصوصیات ژنوم | 24 | |
| 9-8) خصوصیات پيكره ويروس | 26 | |
| 9-9) تکثیر ویروس ایکس سیب زمینی در گیاه | 27 | |
| 9-10) تنوع ژنتيكي ویروس ایکس سیب زمینی | 28 | |
| 10- روشهاي رديابي ویروس ایکس سیب زمینی | 30 | |
| 10-1) سرولوژی | 30 | |
| 10-2) بررسيهاي مولكولي واکنش زنجیرهای پلیمراز Polymerase Chain Reaction (PCR) | 32 | |
| 11- مطالعات انجام شده در ایران | 37 | |
| 12- هدف از اين تحقيق
| 40 | |
| فصل دوم:مواد و رو شها | ||
| 1- جمع آوری نمونه از مزارع سیب زمینی | 42 | |
| 2- آزمون الايزا Enzyme-Linked Immunosorbent Assay- ELISA)) | 42 | |
| 2-1) تهیه بافرها | 42 | |
| 2-1-1) بافرفسفات پتاسیم(PH, 7.4), (phosphate buffered saline-PBS) | 43 | |
| 2-1-2) بافر پوششی کربنات سدیم(PH, 9.6) , (Coating buffer) | 43 | |
| 2-1-3) بافر شستشو (PH,7.4),(Washing buffer) | 43 | |
| 2-1-4) بافر عصاره گیری (PH,7.4),(Extraction buffer) | 43 | |
| 2-1-5) بافر ترکیب پادتن-آنزیم (PH,7.4),(Conjugate buffer) | 43 | |
| 2-1-6) بافر زمینه (سوبسترا)(PH, 9.8),(Substrate buffer) | 44 | |
| 3- بررسیهای گلخانهای | 45 | |
| 4- بررسی انتقال | 46 | |
| 4-1) بررسی انتقال با سس | 46 | |
| 4-2) انتقال با تماس | 46 | |
| 5- بررسي خصوصيات مولكولي | 46 | |
| 5-1) استخراج آر.ان.اي (RNA Extraction) | 46 | |
| 5-2) واکنش زنجیرهای پلیمراز به روش رونوشت برداري برگردان (RT-PCR) | 48 | |
| 5-2-1) مرحله رونوشت برداری برگردان (Reverse transcriptase) | 48 | |
| 5-2-2) مرحله واکنش زنجیره ای پي. سي. آر | 48 | |
| 5-3) مشاهده محصول واكنش | 49 | |
| 5-4) خالص سازی قطعات تکثیر شده | 49 | |
| 5-4-1) جدا کردن قطعه ژل حاوی DNA تکثیر شده | 49 | |
| 5-4-2) حل کردن قطعه ژل و آزاد شده قطعه DNA | 49 | |
| 5-4-3)رسوب دادن DNA | 50 | |
| 5-4-4)شستشوی رسوب با بافر شستشو | 50 | |
| 5-4-5) حل شدن DNA در آب | 50 | |
| 5-6) آنالیز تبارازیی | 51 | |
| 6- خالص سازی ویروس PVX | 53 | |
| 7- اسپکتروفتومتری و تعیین غلظت ویروس جدا شده در آموده های(پرپارسیون) خالص شده | 55 | |
| فصل سوم:نتیجه گیری | ||
| 1- بررسی علائم آلودگيهای موجود روی سیب زمینی | 56 | |
| 1-1) علائم آلودگی روی سیب زمینی | 56 | |
| 1-2) نشانه های آلودگی روی گوجه فرنگی | 57 | |
| 2- آزمون بیولوژیکی (واکنش گیاهان محک در مقابل عصاره حاوی ویروس ایکس) | 58 | |
| 2-1) گل تکمهایی Gomphrena globosa L. | 58 | |
| 2-2) داتوره Datura stramonium | 59 | |
| 2-3) سلمکChenopodium amaranticolor | 59 |
| 2-4) توتون Nicotiana glutinosa L | 60 |
| 2-5) توتون Nicotiana tabacum. cv. White Burley | 60 |
| 2-6) توتون Nicotiana tabacum. cv. Samsun | 61 |
| 2-7) گوجه فرنگی Lycopersicum esculentum Mill | 61 |
| 2-8) لوبیا Phaseolus vulgaris L.cv. Bountiful | 61 |
| 2-9) باقلا. Vicia faba | 61 |
| 2-10) ماش. Vicia sativa L. | 62 |
| 2-11) دامنه میزبانی و علائم | 62 |
| 3- درجه حرارت غیر فعال شدن (TIP) | 63 |
| 4- آخرین حد رقت (DEP) | 63 |
| 5- پایداری ویروس در شرایط آزمایشگاه (LIV) | 63 |
| 6- مطالعه روش های انتقال | 63 |
| 6-1) انتقال با سس | 63 |
| 6-2) انتقال با تماس | 63 |
| 7- خالص سازی | 63 |
| 7-1) روشShepard, 1972 | 63 |
| 7-2) روشFribourg,1975 | 64 |
| 7-3) روشMoreira, 1980 | 65 |
| 8- تعیین پراکنش ویروس بر اساس آزمون الایزاELISA | 65 |
| 9- بررسي خصوصيات مولكولي | 72 |
| 9-1) نتايج حاصل از استخراج آر.ان.اي كل گياه (RNA Extraction) | 72 |
| 9-2) نتايج واکنش رونوشت برداري برگردان زنجیرهای پلیمراز (RT-PCR) | 73 |
| 10) آنالیز تبازایی | 74 |
| فصل چهارم:بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات | 76 |
| فهرست منابع فارسی | 84 |
| فهرست منابع انگلیسی | 85 |
| چکیده انگلیسی | 96 |
فهرست جداول | ||
| جدول1-1 اسامي ويروس هاي سيب زمينی | 18 | |
| جدول 1-2 مقايسه بين ELISA, PCR, IC-PCR, RT-PCR-ELISA | 35 | |
| جدول1-3 توالي آغازگرهای استفاده شده براي سنتز cDNA جهت رديابي ويروس ايكس سيبزميني | 37 | |
| جدول2-1 منطقه و تعداد نمونه های جمع آوری شده از مزارع سیب زمینی در همدان | 42 | |
| جدول2-2 گیاهان میزبانی که برای مایه زنی ویروس ایکس سیب زمینی استفاده شد | 45 | |
| جدول2-3 آغازگرهای استفاده شده در آزمون RT-PCR | 49 | |
| جدول2-4 ليست توالي‌هاي کامل پروتئین پوششی PVX موجود در بانك ژن كه براي مقايسه با جدايه‌هاي ايراني مورد استفاده قرار گرفته‌اند | 52 | |
| جدول3-1درصد نمونه های علائم دار جمع آوری شده از مزارع همدان | 57 | |
| جدول3-2 علائم ویروس ایکس بروی گیاهان محک | 62 | |
| جدول 3-3 درصد آلودگی به چهار ویروس PVX، PVY، PVS و PLRV در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ | 65 | |
| جدول3-4 درصد آلودگی همزمان در مزارع استان همدان | 66 | |
فهرست نمودارها | |
| نمودار1-1 توزيع ميزان توليد سيب زميني در استانهاي كشور | 16 |
| نمودار3-1(Shepard, 1972) Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation | 64 |
| نمودار3-2(Fribourg,1975) Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation | 64 |
| نمودار3-3 Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation(Moreira,1980) | 65 |
| نمودار3-4 نمودار 3-4درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی منطقه بهار | 68 |
| نمودار3-5 درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی در منطقه رزن | 69 |
| نمودار3-6 درصد آلودگی مزارع سیب زمینی در منطقه کبودر آهنگ | 71 |
| نمودار3-7 درصد آلودگی ویروس ایکس سیب زمینی در مزارع سیب زمینی استان همدان | 72 |
فهرست اشکال | |
| شكل1-1 ویروس PVX همراه با ويروس TMV حالت هم افزایی داشته و علائم شديد Double streak را ایجاد میکند | 21 |
| شكل1-2 گياه سيب زميني آلوده به ويرو س ايكس سيب زميني با علائم موزاييك | 22 |
| شکل1-3 مدل حرکت Potexivirus | 26 |
| شكل1-4 مقایسه حساسیت روش های RT-PCR(A) و DAS-ELISA (B) برای ردیابی ویروس ایکس سیب زمینی | 34 |
| شکل 3-1 علائم موزائیک و نکروز در بوته سیب زمینی آلوده به دو ویروس ایکس و وای سیب زمینی | 57 |
| شکل 3-2 نمونه گوجه فرنگی مشکوک به علائم ویروسی | 58 |
| شکل3-3 لکه های نکروز، 15 روز پس از مایه زنی عصاره حاویPVX روی گل تکمه ایی | 58 |
| شکل3-4 لکه های سبز روشن پس از 10 روز مایه زنی عصاره حاویPVX روی داتوره | 59 |
| شکل3-5 ظهور لکه های سبزرد( کلروتیک) (سمت راست) و سپس سیستمیک در گیاه سلمک (سمت چپ) | 59 |
| شکل3-6 لکههای سبزرد (کلروتیک) و موزاییک روی برگ N.glutinosa L مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX | 60 |
| شکل3-7علائم پيسك (ماتل)و رگبرگ روشنی روی Nicotiana tabacum. cv.White Burley مایه زنی شده توسط جدايه PVX | 60 |
| شکل3-8 علائم لكه هاي كلروز و نكروز سيستميك در گياه گوجه فرنگی 12 روز بعد از مایه زنی توسط PVX | 61 |
| شکل3-9 علائم زردی و موزائیک روی برگهای ماش مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX | 62 |
| شکل3-10 عکس از باند حاصل شده ازRNA استخراج شده بروش Tri-Reagent | 73 |
| شكل 3-11 الكتروفورز محصولات PCR مربوط به تكثير پروتئین پوششی با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي، در ژل آگاروز يك درصد | 74 |
| شکل 3-12 درخت تبارزايي جدايه‌هاي ايراني PVX با ساير جدايه‌ها كه با روش NJ و 100 مرتبه bootstrap بدست آمده است. | 75 |
راهنمای خرید و دانلود فایل
برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.
بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.
در صورت بروز هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.
برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایید.
ديدگاه ها