تعیین ترادف اپرون ار. ان. ای ریبوزومی و آنالیز فیلوژنتیکی فیتوپلاسماهای همراه با بیماری تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر : پایان نامه ارشد کشاورزی
کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” تعیین ترادف اپرون ار. ان. ای ریبوزومی و آنالیز فیلوژنتیکی فیتوپلاسماهای همراه با بیماری تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر ” با گرایش بیماری شناسی گیاهی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.
چکیده تعیین ترادف اپرون ار. ان. ای ریبوزومی و آنالیز فیلوژنتیکی فیتوپلاسماهای همراه با بیماری تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر:
بیشتر بیماری تورم جوانه بادنجان و گوجه فرنگی به عنوان یک بیماری شایع و خسارتزا از استان بوشهر گزارش شده است. تحقیق مذکور بوته های آلوده بادنجان و توتون استان بوشهر متعلق به مناطق بنداروز، برازجان، بوشهر و کنگان را پس از انتقال به آزمایشگاه مرکز تحقیقات کشاورزی و منبع طبیعی فارس-زرقان مورد بررسی و مطالعه قرار داده و ذکر نموده است که جدایه های مورد مطالعه بر اساس علائم ایجاد شده در گیاه پروانش به سه گروه تقسیم می شوند. RFLP ژن ریبوزومی 16S نیز نتایج داده های بیولوژیک را تایید کرده است.
پیرو تحقیق مذکور، در این تحقیق تعداد شش جدایه شامل پنج جدایه از بادنجان و یک جدایه توتون موجود بر روی گیاه پروانش انتخاب و دی.ان.ای استخراج شده از بافتهای گیاهی (نمونه های برگ پروانش) طبق روش پیشنهادی مایکسنر و همکاران (1995) در آزمایش های بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. در آزمون PCR با بکارگیری جفت آغازگر P1/P7 ناحیه اپرون ار. ان. ای ریبوزومی جدایه های مذکور تکثیر گردید. هضم محصول PCR با آنزیم های Rsa I و Hinf I جدایه های مورد مورد تحقیق را به 3 گرو تقسیم کرد (جدای های 1،4 و 5 در یک گروه، جدایه 2 در یک گروه و جدایه 3 و 6 در گروه دیگر)، آنزیم Hae III جدایه ها را به دو گروه تقسیم کرد (1، 2، 4 و 5 در یک گروه و جدایه های 3 و6 در گروه دیگر) ولی آنزیم Alu I نتوانست مابین جدایه ها تمایز حاصل کند.
قطعه های تکثیر شده در آزمون PCR با استفاده ازIns T/A clone PCR Product Cloning Kit (MBI Fermentas) در پلاسمید PTZ57R/T وارد و در سویه DH5α باکتری Escherichia coli همسانه سازی گردید. آنالیز ترادف نوکلئوتیدی نتایج آزمون RFLP را تایید و جدایه ها را در سه گروه قرار داد. لازم به ذکر است آنالیز فیلوژنتیک ناحیه اپرون ریبوزومی گروه یک را به دو زیر گروه تقسیم کرد بطوری که جدایه 1، 4 را در یک زیر گروه و جدایه 5 در زیرگروه دیگر قرار گرفت. علاوه بر این جدایه های گروه 2 (جدایه های 3 و 6) نیز هر کدام در یک زیر گروه قرار گرفتند. البته جدایه 3 با داشتن یک جایگاه برشی اضاف تر در موقعیت 938 با آنزیم برشی Hpa II می تواند از جدایه 6 متمایز گردد.
مقدمه
براساس خوشبینانه ترین برآوردها، جمعیت جهان در پایان نیمه اول قرن بیست و یکم از مرز ده میلیارد نفر خواهد گذشت. این در حالی است که بانک جهانی در سال 1994 اعلام کرده حدود هشتاد و سه درصد از این جمعیت مربوط به کشور های در حال توسعه می باشد. بدون شک مهمترین و حیاتی ترین نیاز این جمعیت عظیم غذا و امنیت غذایی میباشد. مطمئنا از طریق افزایش بهره وری، استفاده مناسب از وسایل و منبع تولید از جمله آب، خاک، نیروی انسانی آموزش دیده و… میتوان به تولید پایدار دست یافت و در نهایت بخشی از امنیت غذایی تامین کرد. در این مبحث حفاظت از گیاهان، کنترل آفات، بیماریها و علف های هرز حائز اهمیت فوق العاده میباشد. بعنوان مثال برابر تخمین وزارت کشاورزی آمریکا بیماریهای گیاهی سالانه 9.1، آفات 7.7 و علف های هرز 6.2 میلیارد دلار فقط در ایالات متحده خسارت وارد میکنند. خسارت گیاهی ناشی از آفات و بیماری ها نه تنها در عرضه مواد غذایی در سطح ملی و بین المللی تاثیر دارد بلکه بر زندگی زارعی که گیاه را برای مصرف مستقیم خود یا حتی برای فروش کاشته است نیز تاثیر خواهد گذاشت.
رده مالیکیوتها گروهی از پروکاریوتهای فاقد دیواره سلولی بوده که از نظر تکاملی از باکتریهای گرم مثبتی که درصد مجموع سیتوزین و گوانین پایین دارند مشتق شده اند. بعضا این گروه توانایی بیماریزایی در گیاهان را دارند. از بیمارگرهای گیاهی واقع در این گروه می توان به اسپیروپلاسماها (دارای سلول های مارپیچ، متحرک و قابل کشت) و فیتوپلاسماها (سلول های غیر مارپیچ و غیر قابل کشت) اشاره کرد (Weisburg et al. 1989). از زمان کشف فیتوپلاسماها در سال 1967 میلادی تا کنون بیش از صد ها بیماری همراه با فیتوپلاسما در بیش از 300 جنس گیاهی شناخته شده است (Lee et al., 2000, McCoy et al., 1979 and Seemuller et al., 1998).
فیتوپلاسماها با نام قبلی شبه مایکوپلاسما(MLO) (IRPCM, 2004) محدود به آوند های آبکشی گیاهان میزبان و همچنین همولنف حشره ناقل میباشند (Lee et al., 2000). این گروه از بیمارگرهای گیاهی در طبیعت توسط ناقلین مکنده که عمدتا زنجرکهای برگی(Leafhopper) بوده و متعلق به خانواده Cicadellidae میباشند (Lee et al., 2000) با روش پایا و تکثیری (Firrao et al., 2005) گسترش پیدا میکنند. البته در مواردی پسیل ها نیز بعنوان ناقل اینها گزارش شده اند (Lee et al., 2000). بیماری های فیتوپلاسمایی اغلب باعث عقیمی و مرگ گیاه میزبان شده و معمولا دارای خسارتی کم و بیش معادل صد در صد می باشند که این خسارت شامل کاهش کیفیت و کمیت محصول میباشد.
در ایران تاکنون پیرامون بیماری های فیتوپلاسمایی تحقیقات گستردهای انجام شده است (صالحی و همکاران 1385). یکی از بیماری های مهم فیتوپلاسمایی در ایران بیماری تورم جوانه در بادنجان، گوجه فرنگی و توتون می باشد (صالحی و ایزدپناه 1377، صالحی و همکاران 1379 و رئوفی و همکاران 1389). علائم در این بیماری شامل: گل سبزی، برگ سانی، تورم جوانه، عقیم شدن، کاهش تعداد و اندازه گل، ازدیاد جوانه های جانبی ساقه، جاروئی شدن انتهای ساقه، طویل شدن غیر معمول میانگره، ریز برگی، تغییر رنگ برگها و جوانه ها، پیچیدگی و قاشقی شده برگها، سرخشکیدگی، زوال و مرگ گیاه میباشد (Lee et al., 2000).
حدود 483 هزار هکتار از اراضی کشور سالانه (سال زراعی 85-1384) به گروه سبزی جات اختصاص داشته است. حدود نیمی از این مقدار در 7 استان خوزستان، فارس، کرمان، اصفهان، هرمزگان، آذربایجان شرقی و همدان کشت شده است. استان بوشهر در این سال با کشت حدود 75/3 درصد سبزیجات مقام 13 را به خود اختصاص داده است. از 17 هزار هکتار سطح زیر کشت در این استان حدود 14 هزار هکتار به محصول گوجه فرنگی و حدود 2 هزار هکتار به سایر سبزی جات از جمله بادنجان، فلفل و… اختصاص داشته است. علاوه بر موارد ذکر شده، استان بوشهر مقام اول تولید گوجه فرنگی خارج از فصل را در کشور به خود اختصاص داده است (آمارنامه کشاورزی 1384).
بیماری تورم جوانه در گیاهان بادنجان، گوجه فرنگی و توتون یکی از مهمترین بیماری های
سیفی جات می باشد (Shew and lucas1991). بیماری تورم جوانه پیشتر از مزارع ورامین-اطراف کرج (اسکندری و همکاران 1349) فارس (صالحی و همکاران 1374) استانهای اردبیل اصفهان و آذربایجان غربی (رشیدی و همکاران 1385) و خراسان (جمشیدی و همکاران 1389) گزارش شده است. این بیماری دارای خسارات عمده و چشمگیری در استان بوشهر و بویژه مناطق برازجان، کنگان و بنداروز میباشد (رئوفی و همکاران 1389). بررسیهای سالهای 1387 و1388 نشان داد که این بیماری در اکثر مزارع بادنجان استان بوشهر وجود دارد. با توجه به علائم ناشی از مایه زنی عامل بیماری تورم جوانه بادنجان به گیاه پروانش و مقایسه چند شکل طولی قطعات برشی محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR-RFLP) نشان داد که فیتوپلاسماهای عامل تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر متنوع است و حداقل به سه گروه تقسیم میشوند. (رئوفی و همکاران 1389).
با توجه به اهمیت بیماری و اینکه ماهیت فیتوپلاسمایی عامل بیماری بویژه از نظر گروهبندی و شباهت و یا تفاوت با فبتوپلاسماهای دیگر در ایران و دنیا مشخص نشده بود، در تحقیق حاضر مطالعات زیر انجام گردید.
1- انتقال همزمان عامل جدایه های مختلف بیماری تورم جوانه به پروانش های همسن و مقایسه علائم بیماری در آنها
2- تکثیر یک قطعه 1800 جفت بازی از اپرون ار. ان. ای ریبوزومی در آزمون PCR با جفت آغازگر P1/P7
3- RFLP فیزیکی محصول PCR با آنزیم های Alu I، Hinf I، Hae III و Rsa I
4- همسانه سازی و تعیین ترادف محصول PCR
5- انجام آنالیز های مختلف مولکولی شامل جستجو با برنامه بلاست، بررسی میزان همولوژی، ترسیم درخت فیلوژنتیکی، RFLP کامپیوتری و در نهایت تعیین موقعیت فیتوپلاسما (فبتوپلاسماهای) عامل تورم جوانه در بین فیتوپلاسماها از نظر گروه های اصلی و زیرگروه ها
فهرست مطالب
| چکیده 1 |
| فصـل اول- مقدمه |
| 1-1- مقدمه 3 |
| فصل دوم- مروری بر پژوهش های پیشین |
| 2-1- بادنجان 7 |
| 2-1-1- تاریخچه بادنجان 7 |
| 2-1-2- مشخصات گیاهشناسی 7 |
| 2-1-3- ارقام بادنجان 7 |
| 2-1-3-1- بادنجان پاکوتاه 7 |
| 2-1-3-2- بادنجان قلمی 7 |
| 2-1-3-3- بادنجان معمولی 8 |
| 2-2- گوجه فرنگی 8 |
| 2-2-1- تاریخچه 8 |
| 2-2-2- مشخصات گیاهشناسی 8 |
| 2-2-3- ارقام گوجه فرنگی 8 |
| 2-3- پروکاریوت های سخت کشت آوندی 9 |
| 2-4- طبقه بندی مالیکیوت ها 10 |
| 2-4-1- توصیف رده مالیکیوت 10 |
| 2-4-2- تاریخچه 11 |
| 2-4-3- توصیف راسته Mycoplasmatales 11 |
| 2-4-4- توصیف راسته Entomoplasmatales 12 |
| 2-4-5- توصیف راسته Anaeroplasmatales 13 |
| 2-4-6- توصیف راسته Acholeplasmatales 14 |
| 2-5- فیتوپلاسماها 15 |
| 2-5-1- مقدمه 15 |
| 2-5-2- عمده تشابه فیتوپلاسماها به مالیکیوت ها 16 |
| 2-5-3- موقعیت تاکسونومیکی فیتوپلاسمای عامل تورم جوانه 17 |
| 2-5-4- مورفولوژی فیتوپلاسما ها 17 |
| 2-5-5- علائم بیماری های فیتوپلاسمایی 17 |
| 2-5-6- انتقال بیماری های فیتوپلاسمایی 18 |
| 2-5-6-1- انتقال مکانیکی 18 |
| 2-5-6-2- انتقال با پیوند 19 |
| 2-5-6-3- انتقال با سس 19 |
| 2-5-6-4- انتقال با ناقل 20 |
| 2-5-7- روش های ردیابی و تشخیص بیماری های فیتوپلاسمایی 21 |
| 2-5-8- تنوع میزبان های گیاهی فیتوپلاسماها 23 |
| 2-5-9- بیماری های فیتوپلاسمایی مهم در تیره Solanaceae 24 |
| 2-5-9-1- تورم جوانه بادنجان و گوجه فرنگی 24 |
| 2-5-9-2- بیماری زردی مینا 24 |
| فصـل سوم- مواد و روش ها |
| 3-1- استخراج دی. ان. ای از بافت گیاهی با استفاده از محلول CTAB 27 |
| 3-2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی 27 |
| 3-2-1- واکنش زنجیره ای پلیمراز 27 |
| 3-2-2- تهیه ژل و انجام الکتروفورز 27 |
| 3-2-3- جفت آغازگرهای مبتنی بر ترادف آپرون ریبوزومی 28 |
| 3-2-4- آزمون چندشکلی قطعات برشی (RFLP) 29 |
| 3-2-5- همسانه سازی 29 |
| 3-2-5-1- اتصال محصول PCR به پلاسمید 29 |
| 3-2-5-2- اتصال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli 30 |
| 3-2-5-3- انتخاب پرگنه های حاوی پلاسمید نوترکیب 31 |
| 3-2-6- محیط کشت های موردنیاز برای همسانه سازی 31 |
| 3-2-6-1- محیط کشت مایع LB 31 |
| 3-2-6-2- محیط کشت جامد LB 31 |
| 3-3- تعیین ترادف و مقایسه با بانک ژن 31 |
| فصـل چهارم-نتایج |
| 4-1- علائم بر روی گیاهان آلوده 34 |
| 4-2- علائم بر روی گیاه محک پروانش 34 |
| 4-3- مطالعه کیفیت دی. ان. ای استخراج شده 38 |
| 4-4- انجام واکنش PCR جهت تعیین آلودگی 39 |
| 4-5- آزمون چندشکلی طولی قطعات برشی 40 |
| 4-6- همسانه سازی و آنالیزهای فیلوژنتیک 44 |
| فصل پنجم- بحث و نتیجه گیری |
| 5-1- کلیات 53 |
| 5-3- علائم 54 |
| 5-4- مطالعات فیلوژنتیک 54 |
| فهرست منابع فارسی 57 |
| فهرست منبع انگلیسی 59 |
فهرست جدول ها
2-1- طبقه بندی شاخه تنریکوتها 10
3-1-. مواد لازم در واكنش PCR 28
3-2 ترادف آغازگر های اختصاصی مورد استفاده در واکنش PCR جهت تکثیر اپرون ریبوزومی 28
3-3- سیکل دمایی واکنش PCR برای جفت آغازگر P1/P7 29
3-4- مواد مورد نياز براي اتصال محصول PCR به پلاسميد pTZ57R/T 30
4-1- جدایه، میزبان، منطقه و علائم گیاهان آلوده 34
4-2- نام جدایه و علائم در گیاه پروانش 35
4-3- فیتوپلاسماهای تورم جوانه گوجه فرنگی و بادنجان جدایه بوشهر 45
4-3- جدایه های موجود در بانک ژن استفاده شده در تحقیق حاضر 45
4-4- – میزان شباهت جدایه های فیتو.پلاسما ایران وسایر نقاط دنیا بر اساس ناحیه P1/P7 46
4-5- – میزان شباهت جدایه های فیتو.پلاسما ایران وسایر نقاط دنیا بر اساس ناحیه 16S r RNA 48
4-6- میزان شباهت جدایه های فیتو.پلاسما ایران وسایر نقاط دنیا بر اساس ناحیه SR 50
فهرست شکل ها
2-1- کلنی های ریز دانه دانه و نیمرویی شکل باکتری جنس Mycoplasma 12
2-2- سلول های غیر مارپیچ از باکتری جنس Entomoplasma 13
2-3- سلول های مارپیچ باکتری جنس Spiroplasma 13
2-4- کلنی های نیمرویی شکل حاصل از کشت باکتری جنس Anaeroplasma 14
2-5- کلنی های نیمرویی شکل حاصل از کشت باکتری جنسAcholeplasma 15
2-6- سلول های فیتوپلاسمایی واقع در آوند ابگشی گیاهان آلوده 16
2-7- علائم بارز بیماریهای فیتوپلاسمایی بر روی میزبان های گیاهی مختلف 18
2-8- انتقال با پیوند 19
2-9- زنجرک جنس Circulifer یکی از مهمترین نافلین فیتوپلاسمایی متعلق به تیره Cicadellidae 20
2-10- زنجرک جنس Macrosteles از جمله ناقلین بیماری های فیتوپلاسمایی 21
4-1- علائم ناشی از انتقال جدایه یک بادنجان 35
4-2- علائم ناشی از انتقال جدایه دو جاروک بادنجان 36
4-3- علائم ناشی از انتقال جدایه سه جاروک بادنجان 36
4-4- علائم ناشی از انتقال جدایه چهار جاروک بادنجان 37
4-5- علائم ناشی از انتقال جدایه پنج جاروک بادنجان 37
4-6- علائم ناشی از انتقال جدایه 6 جاروک توتون 38
4-7- محصول الکتروفورز دی. ان. ای استخراج شده در ژل آگاروز یک درصد 38
شکل4-8- نانودراپ دی. ان. ای نمونه جاروک توتون 39
4-9- الکتروفورز محصول PCR مستقیم با استفاده از جفت آغازگرP1/P7 40
4-10- برش محصول PCR اپرون ار. ان. ای ریبوزومی (ناحیه P1/P7) با بکار گیری آنزیم برشی Rsa I 41
4-11- برش محصول PCR اپرون ریبوزومی (ناحیه P1/P7) با بکار گیری آنزیم برشی Alu I 41
4-12- برش محصول PCR اپرون ریبوزومی (ناحیه P1/P7) با بکار گیری آنزیم برشی Hae III 42
4-13- برش محصول PCR اپرون ریبوزومی (ناحیه P1/P7) با بکار گیری آنزیم برشی Hinf I 42
4-14- برش کامپیوتری اپرون ار. ان. ای ریبوزومی (ناحیه P1/P7) با بکار گیری آنزیم برشی Taq I 43
4-15- برش کامپیوتری اپرون ار. ان. ای ریبوزومی (ناحیه P1/P7) با بکار گیری آنزیم برشیHpa II 44
4-16- دندروگرام حاصل از مقایسه تنوع نوکلئوتیدی اپرون ریبوزومی (ناحیه P1/P7) 47
4-17- دندروگرام حاصل از مقایسه تنوع نوکلئوتیدی ژن ریبوزومی S16 49
4-18- دندروگرام حاصل از مقایسه تنوع نوکلئوتیدی ناحیه ژنومی SR 51
راهنمای خرید و دانلود فایل
برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.
بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.
در صورت بروز هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.
برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایید.
ديدگاه ها