بررسی ساختار تنوع ژنتیکی جمعیت های گندم نیای وحشی Aegilops crassa در ایران با استفاده از نشانگرهای بین ریزماهواره ژنومی و صفات ریختی : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان”  بررسی ساختار تنوع ژنتیکی جمعیت های گندم نیای وحشی  Aegilops crassa در ایران با استفاده از نشانگرهای بین ریزماهواره ژنومی و صفات ریختی” با گرایش  کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده بررسی ساختار تنوع ژنتیکی جمعیت های گندم نیای وحشی Aegilops crassa در ایران با استفاده از نشانگرهای بین ریزماهواره ژنومی و صفات ریختی:

گیاه Aegilops crassa ،دارای دو سیتوتیپ تتراپلوئید وهگزاپلوئید با ژنوم ( 2n=2x=28 M^crM^crD^cr1D^cr1 ) و (2n=6x=42 M^crM^crD^cr1D^cr1 D^cr2D^cr2  ) است. این گیاه  یکساله و متعلق به خانواده گرامینه و طایفه Triticeae می باشد. بررسی تنوع ژنتیکی در ژرم­پلاسم گیاهی پیش­نیاز هر برنامه­ی اصلاحی یا حفاظتی گیاهان است. این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی بین 16 جمعیت Ae.crassa با استفاده از 10 آغازگر ISSR انجام شد. DNA ژنومی از گونه­ ها در مرحله­ ی دو تا سه برگی به روش CTAB با اندکی تغییرات استخراج و نتایج تکثیر با آغازگرهای مختلف روی ژل آگاروز 5/1 درصد مشاهده شدند. باندهاي تکثير شده به صورت حضور باند (يک) و ع دم حضور باند (صفر) امتيازده ي و با نرم­افزارهای مولکولی و آماری، تجزیه و تحلیل داده­ها  انجام گرفت. همچنین این آزمایش در قالب طرح آزمایشی اگمنت (در 3 بلوک) در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام انجام شد. از میان نمونه‌های ارزیابی شده سه نمونه که دارای بذر بیشتری بودند به عنوان شاهد استفاده شدند

. نتایج تکثیر DNA ژنومی با استفاده از آغازگرهای ISSR، در مجموع 105 آلل تولید کرد که از این تعداد 86 آلل (9/81 درصد)، به عنوان آلل چندشکل تشخیص داده شد. اندازه آلل­ های تکثیر شده از 190 (آغازگر UBC840) تا 1500 جفت باز (آغازگر 12،14) بود. محتوای اطلاعات چندشکلی از 17/0 در آغازگر UBC842 تا 34/0 برای آغازگر 12 متفاوت بود. همچنین با استفاده از نشانگر ISSR به ترتیب بیشترین و کم­ترین درصد باندهای چندشکل در جمعیت IUGB-00319 (05/39 درصد) و IUGB-01564 (48/10درصد) مشاهده گردید. جمعیت IUGB-00319 بالاترین شاخص تصحیح شده هتروژنی و میزان شاخص شانون را به خود اختصاص داد. آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که سطح بیشتری از تنوع به درون جمعیت­ها (53 درصد) تعلق داشت، درحالی که (47 درصد) تنوع در بین جمعیت­ها مشاهده گردید. همچنین تجزیه خوشه ای داده‌ها با استفاده از ماتریس شاخص Nei با الگوریتم Nj انجام شد. دندروگرام بدست آمده جمعیت­ها را به سه گروه و زیر گروه ­هایی تقسیم نمود و تا حدی عدم ارتباط بین تنوع مولکولی و تنوع جغرافیایی را نشان داد. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که نشانگرهای ISSR برای ارزیابی میزان تنوع ژنتیکی در آژیلوپس کراسا مفید است.

 مقدمه

ایران یکی از غنی ترین مراکز دنیا از نظر ذخایر ژنتیکی گیاهی محسوب می‌شود. به عقیده گیاه شناسان ایرانی حدود 10 الی 12 هزار گونه گیاهی در ایران وجود دارد که آن را به عنوان یکی از غنی ترین مراکز تنوع ذخایر توارثی گیاهی در جهان ساخته است.گونه های وحشی به لحاظ داشتن ژن های مفید برای مقاومت به تنش های زنده و غیرزنده و گسترش سازگاری ژنتیکی در برابر تغییرات محیطی دارای اهمیت می‌باشند. برای استفاده از این منابع، اطلاع از ماهیت و  میزان تنوع موجود در ژرم‌پلاسم، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است [108] . بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان زراعی برای برنامه های اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به هیبرید مناسب از اهمیت زیادی برخوردار است [109]. بررسی تنوع ژنتیکی همچنین از جنبه مدیریت موثر و حفظ منابع ژرم پلاسم دارای اهمیت می‌باشد [96].

روش‌هایی که برای تخمین تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته‌اند متفاوت می‌باشند. از جمله‌ی آن‌ها می توان ثبت شجره، خصوصیات مورفولوژیکی و نشانگرهای مولکولی را نام برد [41]. آگاهی از تنوع ژنتیکی ژرم‌پلاسم ها معیاری مناسب برای استفاده از آن‌ها در شناسایی و انتقال ژن‌ها در بهبود گیاهان زراعی می‌باشند [41]. تنوع ژنتیکی اساس بيشتر برنامه‌هاي اصلاحي بوده و انجام گزينش منوط به وجود تنوع ژنتيكي مطلوب از نظر ویژگیهای مورد بررسي مي‌باشد [32]. مطالعه تنوع ژنتيكي فرآيندي است كه تفاوت يا شباهت گونه‌ها، جمعيت‌ها و يا افراد را با استفاده از روش‌ها و مدل‌هاي آماري خاص بر اساس صفات مورفولوژيك، اطلاعات شجره‌اي یا خصوصيات مولكولي افراد بيان می‌کنند [32]. تعیین سطح تنوع ژنتیکی یکی از مراحل اساسی در مدیریت مؤثر و استفاده از ذخایر ژنتیکی می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد

منابع ژنتيكي يا ذخاير توارثي به دليل اهميت فراواني كه دارند يكي از ارزشمند ترين ثروت هاي ملي و منابع پايه اي در هر كشور محسوب مي‌شوند [1]. یکی از عواقب اصلاح‌نباتات موفق، افزایش فرسایش یا کاهش منابع ژنتیکی گیاهی بوده که تحت برنامه انتخاب قرار گرفته‌اند. در سال های اخیر عوامل بسیار زیادی در فرسایش ژنتیکی و نابودی ذخایر ژرم‌پلاسم نقش داشته‌اند [16]. استفاده از واریته‌های اصلاح شده بجای واریته‌های بومی، اعمال روش‌های مدرن زراعی مانند استفاده از سموم علف‌کش، پیشرفت شهرها و مراکز صنعتی، مسکونی شدن زمین های زراعی و مرتعی، تغییر روش های کشت و سایر عواملی که منجر به فرسایش و انقراض مواد با ارزش می‌شوند که به‌طور مستقیم وغیر مستقیم در کشاورزی و اصلاح نباتات قابل استفاده هستند. بنابراین حفاظت و استفاده از منابع ژنتیکی گیاهی برای بقا و بهبود تولیدات زراعی ضروری بوده و به عنوان نیازی اساسی در توسعه پایدار و کاهش فقر محسوب می‌شود. تنوع ژنتیکی اساس اکثر برنامه های اصلاح نباتات می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد

موفقیت در اصلاح یک گیاه زراعی، در درجه اول به دسترسی تنوع ژنتیکی موجود در آن گیاه بستگی دارد، ضمن اینکه تنوع ژنتیکی یکی از ارکان اصلی کشاورزی پایدار است و وجود تنوع ژنتیکی در نظام‌های زراعی با درس گرفتن از طبیعت باید همواره مد نظر قرار گیرد. مدیریت و استفاده صحیح از تنوع موجود در ارقام محلی و خویشاوندان وحشی یک گونه گیاهی در اجرای برنامه‌های موثر اصلاحی بسیار مهم است.

اولین قدم در اصلاح یک گیاه، شناسائی دقیق ساختار ژرم‌پلاسم آن گیاه است که این مطلب خود نمونه‌گیری منظم و دقیق از ژرم‌پلاسم را برای اهداف اصلاحی و حفاظتی امکان پذیر خواهد ساخت. کاهش تنوع علاوه بر کاهش بازده برنامه های اصلاحی، باعث یکنواختی ژنتیکی در مزارع و آسیب‌پذیری شدید محصولات کشاورزی در برابر آفات، بیماری‌ها و تنش‌های محیطی می‌گردد. خویشاوندان وحشی گیاهان، دربردارنده منابع ژنی با ارزش برای مقاومت به تنش‌های زنده و غیرزنده می باشند.

توده‌هاي وحشي و نژادهاي بومي از مهم‌ترين منابع تنوع ژنتيکي در دسترس مي‌باشند [26]. اهلي‌سازي جمعيت‌هاي برتر انتخاب شده از بين تعداد زيادي توده مي‌تواند پيشرفت قابل توجهي در تأمين نياز صنايع وابسته بدون نياز به روش‌هاي پرهزينه و گران اصلاحي ايجاد نمايد [26]. اهلي‌کردن، فرآيندي طولاني است، اما با انتخاب مناسب در شروع به شدت بر سرعت آن افزوده مي‌شود [26]. بنابراين، با بررسي تنوع موجود، آگاهي از ساختار ژنتيکي جمعيت و بررسي تنوع فنوتيپي و ويژگي‌هاي شيميايي مي‌توان در بين توده‌هاي طبيعي به انتخاب، به‌عنوان اولين روش اصلاحي در طي اهلي‌کردن پرداخت [26]. تنوع ژنتيکي، کليدي براي به‌نژادي گياهان است. دانش روابط ژنتيکي بين توده‌هاي مختلف به مديريت ژرم‌پلاسم کارآمد و استراتژي‌هاي بهره‌برداري کمک بزرگي مي‌نمايد. تنوع ژنتيکي گياهان طي هزاران سال ايجاد شده و در طبيعت به صورت پايدار باقي مانده است [26].

ارقام بومی گیاهان زراعی و خویشاوندان وحشی آن‌ها، به دلیل قدمت و سازگاری‌شان به شرایط زیستی و عوامل نامسائد محیطی دارای مناسب‌ترین ژن‌ها بوده وتنوع ژنتیکی مورد نیاز اصلاح گیاه را تأمین می‌نماید [13]. تعیین میزان تنوع ژنتیکی در مواد گیاهی گام اولیه برای شناسایی، حفظ ونگهداری ذخایرتوارثی ونیز پایه اساسی و اولیه برای تحقیقات ژنتیکی و برنامه‌های اصلاحی می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [27].

 اهداف تحقيق

به طور کلی اهداف اصلی این تحقیق عبارت بودند از:

1. شناخت ارتباط ژنتیکی بین و درون توده های crassa ، گروه بندی آن‌ها و تشکیل یک درخت‌واره براساس انگشت‌نگاری[12] ژنومی حاصل از نشانگرهای ISSR
2. بررسی صفات ریختی و عملکرد و اجزای عملکرد علوفه و دانه
3. مطالعه میزان تنوع و تفرق ژنتیکی جمعیت‌های شناسایی شده به منظور مدیریت بهتر ژرم‌پلاسم موجود و استفاده بهینه از آن در برنامه های به‌نژادی
4. استفاده از اطلاعات بدست آمده در برنامه‌ریزی حفاظت ژرم‌پلاسم و ایجاد کلکسیون از جمعیت های crassa

 فهرست مطالب

فهرست جدول­ها ص

فهرست شکل­ها…………………………..  ط

فصل اول (مقدمه و اهداف 1

1-1- مقدمه 2

1-2- اهداف 7

فصل دوم (کليات و مرور منابع 8

2-1- اهمیت منابع ژنتیکی.. 9

2-2- طبقه بندی منابع ژنتیکی گیاهی.. 9

2-2-1- گونه‌های وحشی.. 9

2-2-2-گونه های زراعی.. 10

2-3- مناطق پراکنش جنس آژیلوپس.. 10

2-4- مناطق پراکنش گونه Ae.crassa. 11

2-5- طبقه بندی گونه Ae.crassa. 11

2-6- تنوع ژنتیکی و اهمیت شناخت آن .. 12

2-7- منشاء تنوع ژنتیکی 13

2-8- اهميت بررسي تنوع ژنتيکي….. 13

2-9- کاربردهاي بررسي تنوع ژنتيکي.. 14

2-9-1- بررسي­هاي فيلوژنتيکي….. 14

2-9-2- ژنتيک جمعيت 14

2-9-3-مديريت گياهان وحشي 14

2-9-4- مدیریت منابع ژنتیکی  15

2-9-4-1- کلکسیون های ذخائر ژنتیک گیاهی………………… 15

2-9-4-1- کنترل بیماری­های گیاهی………………………………… 15

2-10- روش های ارزیابی تنوع ژنتیکی…………………………….. 16

2-11- نشانگرهای ژنتیکی 16

2-11-1- نشانگرهای مورفولوژیک.. 16

2-11-2- مزایا و معایب نشانگرهای مورفولوژیک.. 17

2-11-3- نشانگرهای مولکولی.. 18

2-11-3-1- خصوصیات مناسب یک نشانگر مولکولی.. 19

2-11-3- 2-اهمیت نشانگرهای مولکولی DNA.. 19

2-11-3-3- نشانگرهای بیوشیمیایی……………………………………. 20

2-11-3-4- نشانگرهای مبتنی بر DNA………………………………. 20

2-11-3-5- نشانگرهای DNA  غیر مبتنی بر PCR………. 21

2-11-3-6- نشانگرهای DNA  مبتنی بر PCR………………… 22

2-11-3-7-  نشانگرهای DNA  مبتنی بر PCR  هدفمند و توالی یابی   22

2-12- نشانگرهای مولکولی ISSR…………………………………………… 23

2-12-1- علل ايجاد چندشکلي حاصل از نشانگر مولکولي ISSR 25

2-12-1-1- نمونه DNA.. 25

2-12-1-2- ماهیت آغازگر.. 25

2-12-1-3- روش مورد استفاده براي تشخيص باندها.. 26

2-12-2- مزایای نشانگرهای ISSR.. 26

2-12-2-1- تکرارپذیری بسیار بالا.. 26

2-12-2-2- دقت بالا……………….. 27

2-12-2-3- تنوع بالا………………………. 27

2-12-2-4-  هزینه پایین………………. 27

2-12-2-5- سرعت و سهولت اجرا……….. 27

2-12-3- معایب نشانگرهای ISSR…………… 27

2-12- 4- انواع نشانگرهاي ISSR…………. 28

2-12-4-1-تکنیک MP-PCR 28

2-12-4-2- تکنیک F-ISSR.. 28

2-12-5-کاربرد نشانگرهاي مولکولي ISSR.. 29

2-12-5-1- انگشت­نگاري ژنومي .. 29

2-12-5-2-   مطالعات تنوع ژنتيکي و تجزيه و تحليل فيلوژنتيکي   29

2-12-5-3-  نقشه­يابي ژنتيکي.. 30

2-12-5-4-  نشانمند کردن ژن و انتخاب به کمک نشانگر.. 30

2-12-5-5- مشخص کردن فراواني توالي­ هاي ريزماهواره­اي 30

2-12-5-6- کاربرد نشانگرهای  ISSR در شناسايي و رده ­بندي گونه ­ها   31

2-13- تجزيه و تحليل تنوع ژنتيکي.. 31

2-14- تخمين فاصله ژنتيکي.. 32

2-14- 1- روش گروه بندی افراد یا جمعیت ها.. 32

2-14-1-1-تجزیه خوشه ای.. 33

2-14-1-2- تجزیه به مختصات اصلی (PCoA).. 34

2-14-2-  معيارهاي سودمندي نشانگرها.. 34

2-14-2-1- محتوي اطلاعات چندشکلي.. 34

2-14-2-2-  احتمال همساني.. 35

2-14-2-3-  قدرت تفکيک.. 35

2-15- مروري بر مطالعات ژنتیکی  و مورفولوژی انجام شده روی گونه های آژیلوپس.. 35

فصل سوم (مواد و روشها)….. 40

3 -1- مواد گياهي.. 41

3-2- آغازگرها.. 43

3-3-  مکان و زمان انجام آزمايش مولکولی.. 43

3-4- عملیات زراعی.. 44

3 -4-1- مشخصات جغرافیایی محل انجام آزمایش مزرعه‌ای.. 44

3 -4- 2- طرح آزمایشی و مراحل اجرای آن.. 44

3 -5- استخراج DNA ژنومی.. 45

3-6- تعیین کمیت نمونه های DNA  ژنومی.. 47

3 -7- تعیین کیفیت نمونه های DNA ژنومی.. 48

3 -8- روش تهیه آگاروز 8/0و 5/1 درصد برای تعیین کمیت وکیفیت و تفکیک قطعات تکثیر شده.. 48

3-9- آماده سازی نمونه ها واجرای الکتروفورز ژل آگاروز   49

3-10- اجزای واکنش زنجیره ای پلیمراز.. 50

3-11- سیکل حرارتی و مراحل واکنش زنجیره­ای پلیمراز.. 50

3 -12-توان و زمان مورد نیاز برای الکتروفورز محصول PCR   51

3 -13- مواد تشکیل دهنده بافرTE.. 52

3-14- تهیه بافر  TAE10X.. 52

3 -15- اتیدیوم بروماید.. 53

3 -16- رنگ بارگذاری.. 53

3 -17- مراحل رنگ آمیزی تا ظاهرسازی قطعات تکثیر شده   53

3-18- تجزیه وتحلیل داده ها.. 54

3-18-1- امتیازبندی باندهای حاصل از داده های مولکولی   54

3-18-2- تجزیه خوشه ای و آنالیز مولکولی…………………….54

فصل چهارم(بحث و نتیجه­ گیری)…………………55

4-1- نتایج استخراج DNA ژنومی.. 56

4 -2- نتایج واکنش زنجیره­ای پلیمراز.. 56

4 -3- محاسبه چندشکلی نشانگرهای ISSR.. 58

4-4- محاسبه محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگرهای ISSR   59

4-5- محاسبه شاخص نشانگر(MI) نشانگرهای ISSR………

4 -5- محاسبه ضرایب همبستگی کوفنتیک.. 61

4-6- ترسیم دندروگرام جمعیت­های Ae.crassa. 62

4-7- تجزیه به مختصات اصلی با استفاده از نرم­افزار DARWin  وترسیم نمودار سه بعدی جمعیت­ها با نرم ­افزار Minitab. 63

4-8- محاسبه فاصله ژنتیکی درون و بین جمعیت­های Ae.crassa. 64

4-9- محاسبه ماتریس فاصله و تشابه ژنتیکی شاخص Nei .

4 -10- میزان آلل­ های چندشکل در جمعیت­های Ae.crassa. 69

4-11- محاسبه شاخص­های ژنتیکی در جمعیت­های Ae.crassa. 70

4 -12- تجزیه واریانس مولکولی.. 71

4-13- بررسی صفات مورفولوژی.. 72

4-13-1- همبستگی ساده فنوتیپی.. 72

4-13-2- تجزیه کلاستر (خوشه ­ای)………………….74

4-13-3- تجزیه به مولفه های اصلی.. 76

4 -13-4- تجزیه علیت (مسیر).. 78

4-14- نتیجه ­گیری کلی مولکولی.. 80

4-15- نتیجه­ گیری کلی مورفولوژیکی………………81

4-15-1 پیشنهادات.. 83

منابع 84

فهرست جدول­ها

جدول 3-1- نمونه­ هاي آژیلوپس کراسا استفاده شده در اين تحقيق…………..44

جدول 3-2-آغازگرهاي ISSR استفاده شده در اين تحقيق 42

جدول 3-3- خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک محل اجرای آزمایش    43

جدول 3-4 اجزاء تشکيل دهنده بافر استخراج ………………………………………….DNA46

جدول3-5-  اجزاي مورد استفاده براي انجام واکنش PCR        50

جدول 3-6- چرخه حرارتي مورد استفاده جهت انجام واکنش PCR      51

جدول 3-7- مواد لازم جهت تهيه يک ليتر بافر TE…… 52…

جدول 3-8- مواد لازم جهت تهيه يک ليتر بافر X10TAE. 52

جدول 3-9- مراحل رنگ­ آميزي تا ظاهرسازي قطعات تکثير شده   53

جدول 4-1- درصد چندشکلی­ محاسبه ­شده­ برای ­هر­آغازگردرتحقیق ­حاضر       59

جدول4-2- محتوای اطلاعات چندشکلی محاسبه شده برای هر آغازگر  60

 جدول 4-9- تجزیه واريانس مولکولي جمعیت  Ae.crassa. 71

جدول 4-1- ضرایب همبستگی بین صفات ارزیابی شده Ae.crassa   73

جدول4-11- سطوح تشابه و فاصله روی 16 جمعیت Ae.crassa  با استفاده از تجزیه کلاسترسلسله مراتبی(آشیانه­ای)………………………. 74

جدول4-12- بردارهای مشخصه برای متغیرهای ارزیابی شده با استفاده از تجزیه به مؤلفه ­های اصلی 77

جدول 4-13- تجزیه ضرایب علیت اثرات مستقیم و غیرمستقیم متغیرهای ارزیابی شده روی عملکرد دانه 79

فهرست شکل­ها

شکل2-1- تصویر شماتیک از ISSR-PCR 24

شکل3-1- نمایی از مزرعه آزمایشی 45

شکل 4-1- نتایج استخراج DNA ژنومی 16 جمعیت Ae.crassa…………………………… 56

شکل 4-2- آلل­ های حاصل از تکثیر DNA جمعیت­های مختلف توسط آغازگرISSR……. 56

شکل 4-3- دندروگرام حاصل از 105 آلل تکثیر شده در 16 جمعیت Ae.crassa با استفاده از ماتریس حاصل از شاخص  Nei با الگوریتم اتصال مجاور…………… 63

شکل4-4- نمودار سه ­بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی 16 جمعیت Ae.crassa با استفاده از داده‌های حاصل از نشانگر ISSR ، بر روی سه مختصات اول،دوم وسوم….   64

شکل 4-5-  ميزان درصد تغييرات درون و بين جمعيت­هاي Ae.crassa……………………   72

شکل4-6- دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر متغیرهای ارزیابی شده روی جمعیت Ae.crassa  ……………..  75

شکل 4-7- اسکری پلات برای متغیرهای ارزیابی شده در Ae.crassa…………………… 76

راهنمای خرید و دانلود فایل

برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.

بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.

در صورت بروز  هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما  پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.

برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود  کلیک نمایید.