بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+- ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش فلزات سنگین : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+- ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش فلزات سنگین ” با گرایش زراعت و اصلاح نباتات و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+- ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش فلزات سنگین:

به منظور بررسی الگوی بیان ژن H⁺– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین بذور این گیاه پس از جمع آوری از منطقه پل فسا واقع در جنوب شهر شیراز در گلخانه بخش زراعت و اصلاح نباتات داشکده کشاورزی دانشگاه شیراز کشت شدند. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. پس از گذشت دو ماه تیمار‏های سرب، جیوه، نقره و کلرید سدیم هر کدام در دو سطح اعمال شدند. سپس در چهار بازه زمانی 0، 6، 48 و 72 ساعت پس از تنش نمونه برداری انجام و سریعا نمونه‏ها در نیتروژن مایع قرار داده و سپس تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- نگهداری شدند. ن

تایج نشان داد که فلزات سنگین مختلف تأثیر متفاوتی روی رشد گیاه و میزان بیان ژن Alha1 دارند. بررسی بیان ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نشان داد که در سطح µM50 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به نقره زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 6 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین در سطح µM 100 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به تیمار نقره در زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 72 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین بیان ژن تحت تأثیر کلرید سدیم در دو غلظت mM 200 و mM 400 در همه زمان‏ها افزایش یافت. همچنین مشاهده شد که مقدار فلزات در گیاه بدون تأثیر بر رشد گیاه افزایش یافت.

این نتایج نشان می‏دهد که این گیاه ممکن است فلزات سنگین را بخوبی در خود نگه داشته و در این میان ژن Alha1 نقش مهمی بازی می‏کند. به طور کلی می‏توان گفت که میزان بیان ژن در گیاه تحت تأثیر نوع فلز، غلظت فلز، اندام مورد نظر، زمان تنش و شرایط تنش تغییر می‏کند.

مقدمه

در محیط‏های طبیعی و شرایط زراعی، گیاهان به دفعات در معرض تنش‏های محیطی قرار می‏گیرند. تنش معمولاً به عنوان یک عامل خارجی که باعث تأثیر منفی بر زندگی گیاه می‏شود تعریف می‏شود. مفهوم واژه تنش همواره با تحمل تنش همراه است که قابلیت گیاه در رو به رو شدن با شرایط نامساعد محیطی است. تطابق و سازگاری به تنش‏های محیطی ناشی از تغییرات در سطوح مختلف اندام‏های موجود زنده از سطح آناتومیک و مورفولوژیک تا سطوح سلولی، بیوشیمیایی و مولکولی رخ می‏دهد. واکنش‏های سلولی به تنش شامل تغییر در چرخه سلولی و تقسیم سلولی، تغییر در سیستم غشاهای داخلی و واکوئلی سلول و تغییر در ساختار دیواره سلولی است که در تمام این پاسخ‏ها شاهد تغییر الگوی بیان ژن یا ژن‏هایی هستیم است که محصول آن‏ها در تنش مؤثر هستند (Taiz and Zeiger, 1991).

اهداف پژوهش ژن رمزکننده

این پژوهش به منظور دستیابی به اهداف زیر انجام شد:

1. بررسی الگوی بیان AlHA1 یک ژن رمز کننده پمپ پروتونی در برگ­های گیاه
   littoralis تحت تنش ­فلزات سنگین
2. مقایسه الگوی بیان AlHA1 تحت شرایط تنش شوری با تنش فلزات سنگین
3. بررسی میزان جذب عناصر سنگین توسط گیاه littoralis تحت شرایط تنش

فهرست مطالب ژن رمزکننده

فصل اول

مقدمه. 1

1-1- تنش…. 1

1-2- شوری خاک… 1

1-3- اثرات شوري بر گياهان.. 2

1-4- تنش فلزات سنگین.. 2

1-4-1- سرب.. 4

1-4- 2- جیوه 4

1-4- 3- نقره 5

1-5- ویژگی‏های پروتئین‌هاي  H⁺-ATPaseغشاي پلاسمايي.. 6

1-6- ویژگی‌های گیاه Aeluropus littoralis. 7

1-7- اهداف پژوهش…. 9

فصل دوم

مروری بر پژوهشهای پیشین.. 10

2-1- انتقال پیام در پاسخ به تنش فلزات سنگین.. 10

2-1- 1- سیستم کلسیم/کالمادولین.. 10

2-1-2- نقش هورمون‏ها 11

2-1-3- تنش اکسیداتیو. 11

2-1-4- مسیر MAPK.. 12

2-2- انواع پمپ‌هاي  ATPase. 12

2-3- H⁺-ATPase و تحمل تنش شوري.. 14

2-4- H⁺-ATPase و تحمل تنش فلزات سنگین.. 15

فصل سوم

مواد و روش‏ها 17

3-1- جمع آوري نمونه‌ها‌ي گیاهی.. 17

3-2- کاشت بذرها 17

3-3- اعمال تیمار. 18

3-4- محلول هوگلند. 19

3-5- اندازه‏گیری میزان عناصر. 20

3-6- طراحي آغازگر. 21

3-7- استخراج دي‏ان‏ا از نمونه‌ي‌ گیاهی با استفاده از روش CTAB تغييريافته‌. 22

3-7-1-تهيه‌ي محلول استخراج. 22

3-7-2- روش کار 22

3-7-3- محلول شستشوي شماره 1. 24

3-7-4- محلول شستشوي شماره 2. 24

3-8- استخراج آر‌ان‌ا 24

3-8-1- روش کار 24

3-9- سنتز رشته اول cDNA.. 26

3-10- واكنش  RT-PCRبرای ژن‏های  AlHA1و مرجع.. 26

3-11- تهيه ژل آگارز. 27

3-12- بافر( X50) TAE.. 28

3-12-1- محلول Tris 28

3-12-2- محلول اتيلن دي آمين تترا استيک اسيد (EDTA) 28

3-13- همسانه‌سازي قطعه مورد نظر در پلاسمید. 29

3-13-1- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی.. 29

3-13-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α. 30

3-13-3- انتخاب همسانه‌ها 31

3-13-4- کشت شبانه‌ي کلنی‌های مثبت.. 32

3-13-5- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری به روش لیز کردن آلکالاینی.. 32

3-13-6- هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب.. 35

3-14- آنالیز‏های آماری.. 36

فصل چهارم

نتايج و بحث… 37

4-1- آنالیز صفات مورفولوژيک… 37

4-1-1- وزن ریشه. 37

4-1-2-وزن ساقه. 39

4-1-3- وزن کل گیاه 40

4-1-4-طول ریشه. 41

4-1-5- طول ساقه. 41

4-1-6-طول کل گیاه 42

4-2- اندازه‌گيري عناصر در گياه. 43

4-2-1- جیوه 44

4-2-2- سرب.. 44

4-2-3- نقره 45

4-3- کميت و کيفيت دي‌ان‌ا استخراج شده. 46

4-4- استخراج RNA از برگ گیاه A. littoralis. 46

4-5 – واکنش زنجيره‌اي پليمراز PCR 47

4-6- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تنش فلزات سنگين  و شوری به روش نيمه کمي.. 48

4-6-1- بررسي اثر سطوح مختلف سرب در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بیان ژن Alha1  49

4-6-2- بررسي اثر سطوح مختلف نقره در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بیان ژن Alha1  50

4-6-3- بررسي اثر سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بيان ژن Alha1  52

4-6-4- بررسي اثر سطوح مختلف جیوه در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بیان ژن Alha1  53

4-7- همسانه‌سازي محصول پي‏سي‏آر. 56

4-8 – نتیجه‏ گیری.. 57

4-9- پیشنهادات.. 58

شکل‏ها

شکل 1-1- خروجH⁺  به خارج سلول در اثر فعالیت پمپ  H⁺– ATPase. 6

شکل 3-1- گیاه رشد کرده A. littoralis درون پرلیت پس از 2 ماه. 18

شكل 3-2- اندازه گياه A. littoralis پس از دو ماه بدون اعمال تیمار. 18

شکل 3-3-  ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T. 29

شکل 4-1- اثر فلزات مختلف و شوري بر وزن ريشه گیاه .A. littoralis. 39

شکل 4-2- اثر فلزات مختلف و شوري بر وزن ساقه گیاه A. littoralis.. 40

شکل 4-3- اثر فلزات مختلف و شوري بر وزن کل گیاه A. littoralis. 40

شکل 4-4- اثر فلزات مختلف و شوري بر طول ریشه در گیاه  A. littoralis. 41

شکل 4-5- اثر فلزات مختلف و شوري بر طول ساقه A. littoralis.. 42

شکل 4-6- اثر فلزات مختلف و شوري بر طول کل گیاه A. littoralis. 43

شکل 4-7- مقایسه میزان جیوه تجمع یافته در اندام هوایی گیاه با شاهد. 44

شکل 4-8- مقایسه میزان سرب تجمع یافته در اندام هوایی گیاه با شاهد. 45

شکل 4-9- مقایسه میزان نقره تجمع یافته در اندام هوایی گیاه با شاهد. 46

شكل 4-10- دي‏ان‏ا استخراج شده از برگ گیاه A. littoralis با استفاده از روش CTAB.. 46

شکل 4-11- استخراج آر‌ان‌ا  از برگ A. littoralis 47

شکل 4-12- قطعات تکثير شده ازcDNAs  تهيه شده با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي.. 48

شکل 4-13- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير سرب به روش نيمه کمي. 50

شکل 4-14- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف سرب در زمان‌هاي مختلف. 50

شکل 4-15- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير نقره به روش نيمه کمي. 51

شکل 4-16- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف نقره در زمان‌هاي مختلف. 52

شکل 4-17- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير کلرید سدیم به روش نيمه کمي. 53

شکل 4-18- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌هاي مختلف. 53

شکل 4-19- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير جیوه به روش نيمه کمي. 54

شکل 4-20- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف جیوه در زمان‌هاي مختلف. 54

شکل 4-21- الکتروفورز استخراج پلاسمید. 56

شکل 4-22- تکثیر قطعه مورد نظر از پلاسمید استخراج شده 57

جداول

جدول 3-1-  عناصر تشکیل دهنده محلول هوگلند. 19

جدول 3-2- تيمارهاي اعمال شده در دو غلظت. 20

جدول 3-3- آغازگر‏های مورد استفاده در این تحقیق همراه با مشخصات و توالی آن‏ها. 21

جدول 3-4- تهیه‌ي محلول استخراج دی‌ان‌ا. 22

جدول 3-5- مواد مورد نياز براي ساخت محلول شتشوي شماره 1. 24

جدول 3-6- مواد مورد نياز براي ساخت محلول شستشوي شماره 2. 24

جدول 3-7-  مواد مورد استفاده در  سنتز cDNA. 26

جدول 3-8- چرخه‌ دمایی در واكنش  RT-PCRژنAlHA1  و ژن رمز کننده Actin. 27

جدول 3-9- مواد مورد استفاده در واكنش پي‌سي‌آر و میزان‌های مورد استفاده. 27

جدول 3-10- مواد تشکيل دهنده بافر TAE. 28

جدول 3-11- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش اتصال. 30

جدول 3-12- چرخه‏های دمایی واکنش کلنی‏ پی‏سی‏آر. 31

جدول 3-13- محتوای محیط کشت LB مایع 7 pH=. 32

جدول 3-14- تهیه‌ي محلول شماره‌ي І. 33

جدول 3-١5- تهیه‌ي محلول شماره‌ي II. 33

جدول 3-١6- تهیه‌ي محلول شماره‌ي III. 34

جدول 3-17- واکنش هضم آنزیمی. 35

جدول 4-1- نتایج تجزیه واريانس صفات مورفولوژيک. 37

جدول 4-2- مقايسه صفات مورفولوژيک مورد مطالعه تحت تنش فلزات مختلف به روش آزمون چند دامنه‏اي دانکن. 38

جدول 4-3- نتایج تجزیه واريانس میزان عناصر سنگین موجود در اندام هوایی گیاه تحت تیمار‏های مختلف. 43

جدول 4-4- مقایسه میانگین میزان فلزات سنگین در اندام هوایی گیاه به روش آزمون چند دامنه‏ای دانکن. 44

جدول 4-5- نتایج تجزیه واريانس میزان بیان ژن تحت تنش فلزات سنگین. 49

راهنمای خرید و دانلود فایل

برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.

بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.

در صورت بروز  هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما  پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.

برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایید.