بررسی الگوی بیان ژنی آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) در ریشه ی گیاه نیشکر (Saccharum Lofficinarum) تحت تنش شوری : پایان نامه ارشد کشاورزی بیوتکنولوژی

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” بررسی الگوی بیان ژنی آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) در ریشه ی گیاه نیشکر (Saccharum Lofficinarum) تحت تنش شوری ” با گرایش بیوتکنولوژی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده بررسی الگوی بیان ژنی آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) در ریشه ی گیاه نیشکر (Saccharum Lofficinarum) تحت تنش شوری:

آنزیم فنیل آلانین (PAL) یکی از مهمترین آنزیمها در مسیر تولید پروپانوئیدها در گیاهان می باشد که نقش کلیدی در تولید این ترکیبات دارد. بیان ژن PAL در پاسخ به طیف وسیعی از محرک های محیطی شامل اشعه ی فرابنفش، دمای بالا و سایر شرایط تنشی افزایش می یابد. در این مطالعه تغییرات بیان ژن و فعالیت آنزیم PAL در ریشه، ساقه و برگ در نیشکر تحت 3 تیمار تنشی ds/m 5/3-5/2 و 6/3-6 و 1/6-8 ارزیابی شد. بمنظور ارزیابی بیان ژن PAL از روش PCR زمان حقیقی رنگ SyberGreen و روش مقایسه ای ΔΔCt استفاده شد. همچنین ژن GAPDH بعنوان کالیبراتور در نظر گرفته شد. میزان فعالیت آنزیم بر اساس تغییر فنیل آلانین به ترانس سینامیک اسید و با استفاده از روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد.

نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش میزان شوری میزان بیان ژن PAL و فعالیت آن در بافت ریشه افزایش یافت. تغییرات یکسانی در بافت برگ و ساقه در پاسخ به شوری در بیان ژن و فعالیت آنزیم مشاهده گردید. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش میزان شوری میزان بیان ژن PAL و فعالیت آن در بافتهای مختلف نیشکر افزایش می یابد.

مقدمه

نیشکر (Saccharum officinarum L.)از گونه Andropogoneae و جزء خانواده گندمیان و جزء گیاهان C4 بطور وسیعی در اطراف زمین در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری کشت می شود. نیشکر بعنوان منبع شکر و بسیاری فراورده های دیگر دارای اهمیت اقتصادی بالائی است و در مقایسه با سایر محصولات کشاورزی از نقطه نظر راندمان تثبیت انرژی در واحد سطح در درجه اول اهمیت قرار دارد. نیشکر حدود 45 تن وزن خشک و 22 تن شکر در هکتار در سال تولید می کند.

بخش جلگه اى خوزستان به علت دارا بودن شرايط مناسب از جمله: خاكهاى رسوبى(علی رغم وجود املاح شور)آب كافي، آفتاب درخشان روزهاى طولانى تنها منطقه در ایران است که نیشکر در آنجا بصورت انبوه کشت می شود، بنا به گفته بسيارى از مورخين رواج كشت نيشكر در ايران از زمان اشكانيان شروع شده است و اوج اهميت نيشكر در خوزستان را قبل از اسلام و دوره ساسانيان بايد جست.

اجرای طرح توسعه نیشکر در خوزستان آثار اقتصادىازجمله تامين شكر، كاغذ، تخته صنعتى (MDF)، فراهم آوردن امكانات توليد گوشت قرمز با استفاده از خوراك دام توليدى، توليد محصولات بيوتكنولوژى ( مانند خمير مايه، الكل و غيره ) و اشتغال زائی را در پی داشته است.

یکی از مشکلات کشاورزی ایران شوری اراضی است. حدود 10 درصد خاکهای ایران را خاکهای شور و سدیمی تشکیل میدهند.افزایش میزان هدایت الکتریکی خاک به بیش از 2 دسی زیمنس بر متر به عنوان شاخص شوری آب مطرح می باشد. گیاهان مقاوم به شوری در طبیعت به طرق مختلفی نسبت به این مشکل سازگاری یافته اند که شامل دامنه ای از تغییرات ریخت شناسی آناتومیکی و فیزیولوژیک می باشد. غالبا گیاهان باساخت ترکیبات مختلف بویژه ترکیبات پلی فنولی فشار اسمزی را تنظیم و در مقابل شوری مقاومت می کنند (برزگر و همکاران 1379).

کاهش آب رودخانه کارون در سالهای اخیر توام با افزایش سطح شوری خاکهای منطقه اثرات زیانباری بر صنعت کشت نیشکر بویژه کاهش تولید داشته است. اثر شوری بر عملکرد نیشکر با تفاوتهای نسبت به واریته های مختلف در مناطق جهان امری قطعی و بدیهی است. در گیاه نیشکر نیز شرایط مشابهی حاکم است. ساخت املاحی چون تری متیل سولفونیو پروپیونات،. فری پولین و برخی ترکیبات فنولیک در برگهای نیشکر تحت تنش اسمزی گزارش شده است. نیشکر در ردیف گیاهان حساس به شوری قرار گرفته و حد آستانه آن ds/m 7/1 است.بین افزایش شوری و رشد و تولید محصول نیشکر ارتباط معکوس وجود دارد. تنش شوری در نیشکر تمایز و طویل شدن میانگره ها و ذخیره قند را در آنها تحت تاثیر قرار می دهد. نتایج تحقیقات اخیر نشان می دهد که به ازا هر واحد افزایش در EC (ds/m) [1]سبب کاهش 9/5 تنی محصول در هکتار میشود. در تحقیقات انجام شده درهفت تپه ایران مشخص شده استکه درمحدوده شوری بین 4-2 افت شدید عملکرد نیشکر اتفاق میافتد. با این حال تفاوت گستردهای در پاسخ واریته های مختلف به شوری و میزان حساسیت و مقاومت آنها در ایران بدست آمده است (شکوه فر و همکاران، 1388) .

با توجه به اینکه آنزیم[2] pal یک آنزیم تنشی و یکی از مهمترین آنزیم های مهم گیاه در تولید فرآورده های فنولی تنظیم کننده فشار اسمزی هستند. به نظر میرسد شناسایی تغییرات بیان ژن این انزیم در برابر تغییرات شوری بتواند شاخص دقیقی از پاسخ میزبان به این تنش را ایجاد نماید و بتوان بر اساس تغییرات بیان این آنزیم نسبت به شناسایی ارقام مقاوم اقدام نمود.

آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL, EC4.3.1.5) اولین واکنش درمسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئید را کاتالیز می کند و ال- فنیل آلانین را بصورت غیر اکسیداتیو دآمینه می کند. طی آن ترانس سینامیک اسید و یون آمونیم شکل می گیرد که ترانس سینامیک اسید پیش ساز ترکیبات متعددی مانند ترکیبات محافظ اسمزی می باشد.

در گیاهان پیشرفته ترانس سینامیک اسید پیش ساز طیف وسیعی از مشتقات فنیل پروپانوئیدها از قبیل فلاونوئید[3]، استیلبن ها[4]، کومارین ها[5]، چوبها، چوب پنبه ها، سایر ترکیبات فنلی دیواره، استرها و آمیدهای محلول و برخی از آلکالوئیدها می باشد PAL ، سنتز و تجمع این ترکیبات در بافتها و گیاهان مختلف را تنظیم می کند و به این دلیل بطور مستقیم در تنظیم سیستم گردش، تجمع چوب و پاسخ در مقابل تخریب مکانیکی و عوامل بیماری زا دخالت دارد. این آنزیم به عنوان آنزیم اساسی در پدیده چوبی شدن دارای بیشینه مطالعات آنزیمی در ارتباط با متابولیسم ثانویه در گیاهان است و حدود یک درصد از کل پروتئین سلول گیاهی را تشکیل می دهد.

PALدر بسیاری گیاهان به عنوان یک ترکیب تترامر که توسط خانواده ژنی کوچکی با چهار عضو در آرابیدوپسیس (4PAL -1PAL) کد می شود. PAL یکی از اولین ژنهای تدافعی گیاهان تشخیص داده شده است که بوسیله تنش های محیطی و عوامل بیماری زا تحریک می شود، همچنین نور، فیتوکروم و تنظیم کننده های رشد بیان این ژن را تحت تاثیر قرار می دهند.

میزان آنزیم PAL در گندمیان ازجمله ذرت غلظت بالائی در مقایسه با سایر گیاهان دارد.

نظربه اهمیت اقتصادی و صنعتی نیشکر در کشور و مشکلات اخیر این صنعت در ارتباط با افزایش شوری آب کارون در سالهای اخیر توام با کاهش تولید ناشی از این تنش ارزیابی شاخص های بیولوژیک پاسخ و شناسایی واریته های مقاوم بر اساس تفاوتهای بیولوژیک مولکولی ضروری می باشد. با توجه به اهمیت انزیم PAL در رشد و نمو و تولید ترکیبات بیولوژیک متعدد بویژه اسمو محافظ ها و عدم وجود اطلاعاتی در این خصوص بویژه در مورد گیاه نیشکر مطالعه مذکور طراحی گردید.

در این تحقیق تغییرات بیان ژن انزیم PAL در بافت ریشه واریته های نیشکر مقاوم به شوری مورد مطالعه قرار خواهد گرفت که به منظور مطالعه ی گسترده تر این تحقیق سنجش تغییرات بیان این انزیم در بافت های ساقه و برگ نیز مورد بررسی قرار گرفت که احتمالا نتایج حاصل از این تحقیق را می توان به منظور شناسایی ارقام مقاوم به شوری استفاده کرد.

فهرست مطالب


چکیده	1
فصل اول: مقدمه	2
فصل دوم: تاریخچه نیشکر در ایران و جهان	6
2- تاریخچه نیشکر در ایران و جهان	7
1-2 تاریخچه نیشکر در جهان	7
2-2 تاریخچه نیشکر در ایران	7
3-2 اکولوژی نیشکر	9
4-2 مورفولوژی نیشکر	10
1-4-2 ریشه	10
1-1-4-2 ریشه های سطحی	10
2-1-4-2 ریشه های میانی	10
3-1-4-2 ریشه های عمیق	10
2-4-2 ساقه	10
3-4-2 برگ	11
4-4-2 گل	11
5-2 زمان کاشت قلمه های نیشکر	11
6-2 محصولات جانبی نیشکر	12
7-2 ارقام تجاری نیشکر	12
1-7-2 رقم CP48-103	12
2-7-2رقمCp57-614	12
3-7-2 رقم Cp65-315	13
4-7-2 رقم Cp69-1062	13
5-7-2 رقم Cp70-321	13
6-7-2 رقم Sp70-1143	14
7-7-2 رقم Cp73-21	14
8-7-2 رقم IRC99-01	14
8-2 بیماری های نیشکر	15
9-2 بیماریهای نیشکر ایران	15
1-9-2 بیماریهای عفونی	15
2-9-2 بیماریهای غیرعفونی	16
10-2 تنش های گیاهی	16
11-2 فیزیولوژی تنش های گیاهی	17
12-2 تنش های گیاهی از نظر موقعیت جغرافیایی و زیست محیطی در ایران	17
13-2 تنش شوری	18
14-2 علائم خسارت زای شوری	19
15-2 اثرات شوری بر گیاه نیشکر	20
16-2 مبانی سمیت سدیم	22
17-2 مکانیسم های تحمل شوری	23
18-2 سازوکارهای تحمل به شوری	24
19-2 سازگاری کل گیاه به تنش شوری	27
1-19-2 تنظیم انتقال Na به اندام هوایی	27
20-2 مسیرهای اولیه ورود به ریشه	28
1-20-2 مسیر حساس به Ca	28
2-20-2 مسیرهای غیرحساس به Ca	29
3-20-2 مسیر انحرافی	29
21-2 دقع Na به خارج از ریشه	30
1-21-2 کنترل میزان برداشت خالص	30
2-21-2 کنترل بارگیری آوند چوب	31
22-2 عوامل موثر در مقاومت گیاهان به شوری	31
23-2 مطالعات سلول شناختی و ژنتیکی	31
24-2 آنزیم فنیل آلانین آمونیا- لیاز	32
25-2 روش های ارزیابی بیان ژن	34
1-25-2 روش لکه گذاری نورترن	35
2-25-2 ارزیابی حفاظت در برابر R-Nase	35
3-25-2 هیبریدیزاسیون درجا	36
4-25-2 روش RT-PCR	36
5-25-2 روش PCR در زمان حقیقی	36
6-25-2 اصول PCR در زمان حقیقی	37
7-25-2 روش های مختلف آزمون PCR در زمان حقیقی	39
1-7-25-2 روش مبتنی بر کاربرد رنگ های فلئورسنت آزاد	39
2-7-25-2 روش های مبتنی بر پروب	40
3-7-25-2 پروب های هیدرولیز شوند یا TaqMan	40
4-7-25-2 پروب های هیبرید شونده	41
26-2 اصول کاربرد PCR در زمان حقیقی در ارزیابی های کمی	42
27-2 روش عمومی برای محاسبه ی نسبت سنجش نسبی بیان ژن	43
فصل سوم: مواد و روشها	44
1-3 وسایل مورد استفاده	45
2-3 مواد مورد استفاده	45
3-3 روش کار	45
1-3-3 نمونه گیری	45
2-3-3 استخراج RNA	46
1-2-3-3 محلولهای مورد نیاز	46
4-3 واکنش سنتز CDNA (RT)	47
1-4-3 روش ساخت CDNA	47
5-3 واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)	48
1-5-3 روش تهیه محلول (PCR)	48
2-5-3 تهیه ی ژل و ارزیابی محصول PCR	49
3-5-3 روش تهیه ی محلول TAE	49
4-5-3 ساخت رنگ بارگذاری	49
5-5-3 بارگذاری نمونه ها	49
6-3 ارزیابی مقایسه کارایی تکثیرژن کنترل داخلی (GaPDH) و ژنPAL	50
7-3 واکنش PCR در زمان حقیقی	50
1-7-3 روش انجام PCR در زمان حقیقی	50
2-7-3 روش تهیه محلول PCR در زمان حقیقی	50
8-3 بررسی مقایسه ای بیان ژن ها	51
9-3 آنالیز آماری داده ها	51
فصل چهارم: نتایج	52
1-4 تعیین کارایی تکثیر ژن PAL و GAPDH	53
فصل پنجم: بحث	60
پیشنهادات	65
منابع فارسی	66
منابع خارجی	67