امکان شناسایی تحمل به تنش خشکی در ژنوتیپ های حساس و متحمل نخود زراعی با استفاده از مارکر مولکولی ISSR : پایان نامه ارشد کشاورزی بیوتکنولوژی
کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” امکان شناسایی تحمل به تنش خشکی در ژنوتیپ های حساس و متحمل نخود زراعی (Cicer arietinum L.)با استفاده از مارکر مولکولی ISSR ” با گرایش بیوتکنولوژی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.
چکیده امکان شناسایی تحمل به تنش خشکی در ژنوتیپ های حساس و متحمل نخود زراعی (Cicer arietinum L.)با استفاده از مارکر مولکولی ISSR:
نخود از جمله مهمترین منابع پروتئینی بشمار میآید که در اکثر مناطق خشک و نیمه خشک دنیا که با کمبود آب روبرو هستند کشت میشود. این گیاه نقش مهمی در رژیم غذایی مردم این مناطق ایفا کرده و نیز به دلیل همزیستی با باکتریهای تثبیت کننده نیتروژن، نقش مؤثری در افزایش حاصلخیزی خاک دارد. در مناطق خشک، مثل کشور ما تنش خشکی به عنوان مهمترین دلیل کاهش عملکرد این گیاه محسوب میشود. تنش خشکی بخصوص خشکی انتهای فصل، مهمترین علت کاهش عملکرد در این نواحی شناخته شده است. بنابراین شناسایی ژنوتیپهای متحمل به این تنش از طریق مولکولی در جهت اصلاح این گیاه اقدامی ضروری به نظر میرسد.
در این پژوهش از آغازگرهای توالی بینابینی تکراری ساده (ISSR)جهت بررسی تعیین ژنوتیپهای متحمل و حساس به خشکی استفاه شده است. از بین 13 آغازگر مورد بررسی آغازگرهای UBC864و UBC868 هرکدام یک باند اختصاصی به ترتیب با اندازههای 550 و 450 کیلوباز در ژنوتیپهای حساس ایجاد نمودند. در نتیجه جداسازی و تعیین توالی این باندهای اختصاصی باند حاصل از آغازگر UBC868 مورد شناسایی قرار گرفت که با عوامل رونویسی بازدارنده ژن MYB5-like %85 همسانی نشان داد.
کارکردهای کلیدی این ژن عبارت است از:
تنظیم کننده سنتز موسیلاژ، رشد و توسعه پوشش بذر، مورفوژنز تریکوم و شاخه زایی. عموماً کارکردهای برشمرده شده این ژن در مرحله جوانه زنی و حتی گیاهچه ای، میتواند در تحمل گیاه به تنش خشکی مفید بوده و از آنجا که عامل بازدارنده رونویسی ژن MYB5 در ژنوتیپهای حساس فعال است، گمان میرود به دلیل عملکرد مختل شده این ژن تحمل گیاه به شرایط کمآبی افزایش یافته باشد. بطور کلی نتایج نشان داد که روش ISSR میتوند روشی تکرار پذیر جهت شناسایی ژنوتیپهای متحمل و حساس باشد و به لحاظ صرفهجویی قابل ملاحظهای در زمان میتواند در تسریع برنامههای اصلاحی مفید باشد.
مقدمه
نخود (Cicer arietinum L.) با 2n=2x=16 کروموزوم و ژنومی به اندازهMbp750یکی از مهمترین نوع حبوبات در کشورهای در حال توسعه بوده و همچنین حائز رتبه سوم در بین تمامی حبوبات است (فائو[1]، 2012). نخود یکی از مهمترین محصولاتحبوبات در هند و کشورهای مجاور آن است که 90% تولید جهانی را به خود اختصاص داده است (گوپتا و همکاران، 2011).به طور کلی، نخود زراعی در میان کلیه محصولات دانهای جهان، رتبه پانزدهم را به خود اختصاص داده است (گائور و همکاران، 2007).این گیاه در دامنه وسیعی از شرایط آب و هوایی، از نواحی نیمه گرمسیری شبه قاره هند و استرالیا تا مناطق مدیترانهای حوزه مدیترانه، غرب آسیا، شمال آفریقا، جنوب و جنوب غربی اروپا کشت میشود (سیدیک و همکاران، 2000). علاوه بر اهميت اين گياه به عنوان يك منبع مهم براي تغذيه انسان و دام، درمديريت حاصلخيزي خاك به ويژه درمناطق خشك نیز میتواند بسیار مؤثر باشد (کلارک و همکاران، 2004؛ وارشنی و همکاران، 2009). بذر نخود حاوی 20 تا 30% پروتئین، 40% کربوهیدرات و فقط 3 تا 6% روغن است.
همچنین، سرشار از عناصر معدنی نظیر Ca، Mg، K، S، Fe، Mn وZn میباشد. تولید کارتنوئیدهای سودمندی مانند بتاکاروتن و همین طور قابلیت تثبیت نیتروژن از دلایل دیگر اهمیت این گیاه به شمار میآید (میلان و همکاران، 2006). نخود از نظر مقدار پروتئین بسیار غنی بوده و از این لحاظ، برای افراد گیاهخوار و آنهایی که قدرت خرید گوشت را ندارند نقش مهمی در تأمین پروتئین رژیم غذایی ایفا مینماید.این گیاه به دلیل تثبیت نیتروژن اتمسفر در کاهش مصرف کود نیتروژنه نقش بسزایی بر عهده دارد. توانایی رشد و محصولدهی نخود در مناطق و شرایط مختلف آب و هوایی حکایت از پتانسیل بالادر این گیاه دارد. با این حال شرایط نامساعد محیطی نظیر خشکی و درجه حرارت بالا در طول دوره رشد به مقدار قابل ملاحظهای از عملکرد آن میکاهد (کوپر، 1998).
تنش خشکی بیشترین تأثیر را در کاهش عملکرد گیاهان دارد. این تنش سبب ایجاد اثرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متعددی در گیاهان میگردد.بیشتر فرآیندهای فیزیولوژیکی وابسته به رشد محصولات زراعی متأثراز کمبود آب یا خشکی است که در مطالعات جهانی، خشکی به همراه دمای زیاد و تابش آفتاب از مهمترین عوامل محدود کننده غیر زیستی محصولات زراعی در جهان است (آراس و همکاران، 2002؛ بویر، 1982). به طور کلی خشکی به دو دسته متناوب و انتهای فصل تقسیم میشود.
در طول خشکی انتهای فصل، آب قابل دسترس گیاه کاهش مییابد و به طور سریع منجر به خشکی میشود و رشد محصولات زراعی کاهش مییابد ولی خشکی متناوب در نتیجه باران ناکافی یا آبیاری ناکافی اتفاق میافتد که لزوما کشنده نیست. بررسیها نشان داده است که از بین تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی، تنش خشکی به تنهایی علت کاهش 50 درصد عملکرد نخود است (آنبسا و بجیگا، 2002؛ سکسینا، 2003). همچنین به این علت که نخود زراعی، اغلب در مناطق خشک و نیمه خشک، تحت شرایط دیم کشت میگردد و از آن جایی که تقریبا 90% محصول جهانی آن، در شرایط دیم تولید میشود، بنابراین تنش خشکی مهمترین عامل محدود کننده آن به شمار میرود (میلان و همکاران، 2006).
کشاورزی در اکثر مناطق جهان با استفاده زیاد آب همراه است که با افزایش روز افزون جمعیت و افزایش خشکسالیهای مکرر میزان آب در دسترس برای تولیدات کشاورزی در حال کاهش است. لذا خشکی به عنوان یکی از تنشهای محیطی محدود کننده عملکردمحصولاتزراعی مطرح میباشد که یکی از راههای مطمئن بر فائق آمدن بر این مشکل اصلاح برای تحمل به تنش خشکی است.در عین حالواریتههای زودرس نخود با قابلیت فرار از خشکی انتهای فصل توسعه یافتهاند، اما بلوغ زودرس روی سقف عملکرد محصول اثرمیگذارد و توانایی محصول زراعی برای بهره برداری از دوره رشد را کاهش میدهد (جانسون و همکاران، 1997).
نشانگرهای مولکولیDNA[2] به طور وسیع در بررسی تنوع ژنتیکی حاصل از موتاسیونها یا اشتباهات در همانندسازی DNA و یا تفاوتهای ذاتی و فردی مورد استفاده قرار میگیرند وبر خلاف نشانگرهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، تحت تأثیر محیط قرار نگرفته و از لحاظ تعداد نامحدود و در تمام مراحل رشد گیاهقابل استفاده بوده و تغییری نمیکنند. علاوه بر کاربرد آنها در تهیه نقشه ژنتیکی، در اصلاح نباتات برای تشخیص تنوع ژرم پلاسم و محصولات زراعی بکار میروند. نشانگرهای مولکولییکی از بهترین راهها برای بررسی تنوع ژنتیکی و زیستی در میان گونهها بوده و به دلیل دارا بودن ویژگیهایی چون تشخیص آسان افراد هتروزیگوت و هموزیگوت، نداشتن اپیستازی، قابلیت وراثت، تشخیص در مراحل مختلف حیات گیاه، عدم محدودیت به مواد بیولوژی، دقت بسیار بالا و آسان بودن اندازهگیری، در سالهای اخیر در امور اصلاح گیاهان زراعی بسیار رایج شده است (ملشینگر، 1990؛میلان و همکاران، 2006).
گذشته از بروز دورههای خشکسالی و کاهش بارندگیها طی سالیان اخیر، تغییرات اقلیمی ناشی از اثرات گلخانهای، تشدید پدیده خشکی را در پی داشته است که به عنوان چالشی اساسی برای عملکرد و تولید گیاهان زراعی مطرح میباشد. قسمت اعظم وقوع و شدت تنش خشکی خارج از کنترل است و تنها مسیر مطمئن برای کاهش پیامدهای آن تولید گیاهان متحمل و یا ایجاد صفات دیگری چون فرار از خشکی است.
بررسیهای انجام شده توسط متخصصان اصلاح نباتات و زیست شناسان مولکولی حاکی از آن است که پاسخ گیاهان به تنشهای محیطی (غیر زیستی) عموماً بصورت چند ژنی و در قالب اثرات افزایشی و غیر افزایشی ژنها کنترل میشود (پنجابی- سابهاروال و همکاران، 2009). بدلیل طبیعت متغیر تنشها و حساسیت فنوتیپ گیاه و نیز مشکلات انتقال صفت تحمل به تنش درژنوتیپهای منتخب، روشهای سنتی اصلاح نباتات با موانع جدی روبرو است. لذا ترکیبی از شیوههای جدید مولکولی نظیر گزینش بوسیله نشانگرهای DNA وQTL[3] میتواند تسریع این فرآیندها را در پی داشته باشد (رن و همکاران، 2005).
بنابراین در تحقیق حاضر ازژنوتیپهای متحمل و حساس استفاده شد که در گذشته مطالعات اولیه فیزیولوژیکی تنش خشکی در دانشگاه فردوسی مشهد بر روی آنها انجام شده است. ضمناً نشانگر مورد استفاده در این تحقیق ISSR[4] بود که به دلیل داشتن آغازگرهایی با طول 16 تا 25 جفت باز از طول بیشتری نسبت به آغازگرهایی مانند RAPD[5] (10 جفت باز) برخوردار بوده و بنابراین امکان تکرار پذیری آنها بالاتر بود.
در این تحقیق برای بررسی تفاوت احتمالی بین ژنوتیپهای متحمل و حساس از 13 آغازگر استفاده شد. هدف از این کار سهولت تشخیص تحمل به تنش خشکی با کمک نشانگرهای مولکولی و همچنین کسب اطمینان بیشتر نسبت به روش تشخیص فیزیولوژیک بود. نشانگرهای مولکولی در این تحقیق به عنوان راهی برای تشخیص تحمل به تنش خشکی فارغ از شرایط محیطی تأثیرگذار بکار برده میشوند.
نخود و اهمیت آن
در حال حاضر حبوبات یکی از مهمترین منابع پروتئینی در رژیم غذایی بسیاری از مردم کشورهای در حال توسعه است. رژیم غذایی در این کشورها عمدتاً نشاسته است که از گیاهانی مثل برنج، گندم، ذرت، ارزن و گیاهان غدهای مثل سیب زمینی بدست میآید. آنچه مسلم است مقدار پروتئین در این محصولات کم بوده و سوء تغذیه میلیونها انسان ساکن در این کشورها یکی از مشکلات حاد این مناطق میباشد. لذا در این مناطق مصرف پروتئینهای گیاهی نظیر حبوبات که سرشار از پروتئین هستند، اهمیت قابل توجهی دارد (باقری و همکاران، 1379). نخود (Cicer arietinum L.)از جمله حبوبات و یکی از قدیمی ترین گیاهان زراعی است که توسط بشر کشت شده است. نخود عمدتاً در جیره غذایی انسان به خصوص در برنامه غذایی طبقات کم درآمد جامعه نقش اساسی داشته و در مقایسه با غلات از تولید پروتئین قابل توجهی در واحد سطح برخوردار است (باقری و همکاران، 1379). به احتمال زیاد نخود از نواحی جنوب شرقی ترکیه و مناطق مجاور آن در سوریه منشأ گرفته است (سینگ، 1997).
تنشهای مختلفی باعث کاهش عملکرد در نخود میشود. این تنشها به دو گروه زیستی و غیر زیستی قابل تقسیم میباشند. هرچند نخود گیاهی مقاوم به خشکی است و دمای پایین را نیز تا حدی به خوبی تحمل میکند ولی دمای مطلوب رشد آن بین 20 تا 30 درجه سانتیگراد است. این گیاه در زمان گلدهی به گرما و تنش خشکی حساس میباشد که این دو عامل بیشترین تأثیر را در کاهش محصول در کشتهای بهاره و دیم اعمال میکنند (باقری و همکاران، 1386).
فهرست مطالب
فصل اول: مقدمه 1
1-1 مقدمه 1
فصل دوم: بررسی منابع 5
2-1 نخود و اهمیت آن 5
2-2 تنشهای مؤثر بر عملکرد نخود زراعی 6
2-2-1 تنشهای زیستی 6
2-2-2 تنشهای غیر زیستی 7
2-3 پدیده بروز خشکی در کشور 8
2-3-1 اثرات تنش خشکی 8
2-4 نشانگرهای مورفولوژیکی 9
2-5 نشانگرهای بیوشیمیایی 10
2-6 نشانگرهای مولکولی 11
2-7 توالیهای تکرار شونده 13
2-7-1 توالیهای تکراری ساده(SSR)یا ریزماهوارهها 14
2-7-1-1 کاربرد نشانگرهای ریز ماهواره در گیاهان 15
2-8 نشانگر مولکولی ISSR 17
2-8-1 منشأ تغییرات چند شکلی در نشانگر ISSR 19
2-8-1-1 DNA الگو 19
2-8-1-2 ماهیت آغازگر مورد استفاده 20
2-8-2 روش شناسایی 22
2-8-3 مزایای ISSR 22
2-8-4 معایب ISSR 23
2-8-5 کاربردهای نشانگر ISSR 23
2-8-5-1 تهیه نقشه ژنتیکی 23
2-8-5-2 گزینش به کمک نشانگر 24
2-8-5-3 انگشت نگاری ژنوم 24
2-8-5-4 تعیین فراوانی موتیفهای SSR 25
2-8-5-5 مطالعه روی جمعیتهای طبیعی و گونهزایی 25
2-8-5-6 تعیین تنوع ژنتیکی 26
فصل سوم: مواد و روش 32
3-1 مواد گیاهی 32
3-2 استخراج DNA 33
3-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده 35
3-3-1 الکتروفورز ژل آگارز 35
3-3-2 روش نانو دراپ 36
3-4 انجام واکنش PCR 36
3-4-1 آغازگرهای ISSR 37
3-4-2 برنامه حرارتی چرخههای PCR 38
3-5 الکتروفورز محصولات PCR 39
3-6 تشخیص باند اختصاصی و تعیین توالی آن 40
فصل چهارم: نتایج و بحث 41
4-1 استخراج DNA 41
4-2PCR با 13 آغازگر با استفاده از مخلوط DNA ژنوتیپهای متحمل و ژنوتیپهای حساس گیاه نخود 44
4-3تعیین بهترین آغازگر(ها) برای تکثیر قطعات ISSR در هشت ژنوتیپ نخود به صورت جداگانه
46
4-4 جداسازی، تعیین توالی و انجام همردیفی باندهای متمایز تکثیر شده 49
فصل پنجم: نتیجه گیری کلی و پیشنهادات 54
پیشنهادات 55
فهرست شکلها
شکل 2-1. انواع نشانگرها 13 شکل 2-2. نمایش اتصال آغازگر (AG)8 به DNA 21 شکل 3-1. گیاهان حاصل از بذرهای کشت شده ژنوتیپهای مختلف در مزرعه پژوهشکده علوم گیاهی 33 شکل 4-1.نمونههایDNAبر روی ژل آگارز 1 درصد با روش .CTAB 42 شکل 4-2.سنجش کیفیت و کمیت یکی از نمونه های استخراج شده توسط دستگاهنانودراپ 43 شکل 4-3. مقایسه محصول PCR با نمونههایDNAاستخراج شده باروش کیت و CTAB 44 شکل 4-4.الکتروفورز ژل آگارز PCR با مخلوط DNAژنوتیپهای حساس و متحمل………….45 شکل 4-5. الکتروفورز ژل آگارز PCRبا 8 ژنوتیپ گیاه نخود با آغازگرهاینشانگر ISSR…..47 شکل 4-6. PCRبا 8 ژنوتیپ گیاه نخود با آغازگرهای نشانگر ISSR 48 شکل 4-7.PCR با 8 زنوتیپ گیاه نخود توسط آغازگرهای ISSR 49 شکل 4-8. همردیفی انجام شده توسط الگوریتم BLAST در پایگاه Gene Bankاز طریق وبگاه NCBI 50 |
فهرست جدولها
جدول 2-1. اسامی مترادف ISSR و تغییرات آن 19 جدول 3-1. تهیه بافر استخراج 35 جدول 3-2. ترکیبات و اجزای مورد استفاده جهت انجام واکنشPCR 37 جدول 3-3. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده جهت تکثیر توالی DNA 38 جدول 3-4. برنامه زمان بندی چرخه حرارتی برای تکثیر آغازگرهای ISSR 39 |
راهنمای خرید و دانلود فایل
برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.
بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.
در صورت بروز هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.
برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایید.
ديدگاه ها