كلون و بيان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α) : پایان نامه ارشد کشاورزی بیوتکنولوژی
کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” كلون و بيان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α) ” با گرایش بیوتکنولوژی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.
چکیده كلون و بيان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α) :
سایتوکاین ها خانواده اي از فاكتورهاي رشد هستند که توسط سلول های سيستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان يك مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهاي تحريك شده با باکتری ترشح می شود. عليرغم ابنكه مقادير محدودي TNF-α از منابع طبیعی آن بدست مي آيد اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراين ترجیح داده می شود براي توليد اين پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده ميكروبي و نيز گیاهان استفاده گردد.
در اينجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ي mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سايت برشي EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بيان، ژن هدف در پلاسمید تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 كلون گرديد به اين ترتيب كه وكتور نوتركيب و نيز هر دو با آنزيم هاي NdeI-HindIII بريده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطي شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسي صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coli از طریق تکنیک های SDS-PAGEو نيز وسترن بلاتینگ مورد تاييد قرار گرفت.
مقدمه
فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکایني پیش التهابی است كه در راه اندازی و تنظیم سيستم ايمني ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب هاي بیماری زا از طريق فراخواني نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α براي اولين بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس يا آندوتوكسين باكتري ها تيمار شده بودند جداسازي شد كه در مرگ سلول هاي توموري نقش ايفاء مي كرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما اين پلی پپتید 17 کیلودالتونی داراي عملكردهاي متعددي نظير دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظيم خواب و رشد رويان مي باشد.اين فاكتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ي CD4+، لنفوسیت هایT ي CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بيان مي شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.
TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نيز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروكاريوتي در كشور می تواند باعث فراهم شدن زمينه جهت انجام تحقیقات بعدی نظير تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نيز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.
بیوتکنولوژی پروتئینهای دارویی
بیوتکنولوژی (زیست فناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآوردههای زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده میکند(Wallman, 1997). گرچه استفاده از میکروارگانیسمها برای تولید فرآوردههای زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزی نظیر تکنیکهای مهندسی ژنتیک و تکنولوژی DNAنوترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917 توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نوترکیب را ارایه دادند و در سال 1976 اولين شركت مستقل بيوتكنولوژي،Genentech، به منظور تجاري كردن اين تكنولوژي جديد تاسيس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نوترکیب با استفاده از تكنولوژي DNA نوتركيب براي نخستين بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002).
پیش از بکار بردن روشهای بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئینهای دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافتهای انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه میشد. همچنین به دلیل مشکل بودن روشهای خالص سازی و از طرفی آلرژیزا بودن پروتئینهای حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود مینمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نوترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است، بیان میشود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب میتوان پروتئینهای دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزانتر از روشهای قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).
در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نوترکیب برای درمان بیماریهای انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماریهای مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتیهای دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).
تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکيب بهره میگيرد. هدف نهايی بيوتکنولوژی دارويی ژن درمانی و ورود مواد ژنتيکی به سلولها برای جلوگيری يا کنترل و يا معالجه بيماری میباشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئینهای دارویی تولید شده به صورت نوترکیب (T. A. Brown) را نشان میدهد.
چکیده | |
| مقدمه علایم اختصاری | |
| فصل اول: بررسی منابع | |
| 1-1- بیوتکنولوژی پروتئینهای دارویی | 1 |
| 2-1- کلونکردن ژن | 3 |
| 1-2-1- ابزار و عوامل کلونکردن ژن | 4 |
| 1-1-2-1- آنزیمهای برشی | 4 |
| 2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز | 5 |
| 2-2-1- وکتورهای کلونینگ | 6 |
| 1-2-2-1- پلاسمیدها | 10 |
| 3-1- سیستمهای بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئینهای نوترکیب | 11 |
| 1-3-1- باکتری E. coli بعنوان میزبان بيان کنندة پروتئینهای نوترکیب | 15 |
| 2-3-1- وكتور بيانكننده | 15 |
| 1-2-3-1- پروموتر | 16 |
| 1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET | 17 |
| 2-2-3-1- منشاء همانندسازی | 18 |
| 3-2-3-1- ماركر انتخابي | 18 |
| 4-2-3-1- خاتمه دهنده رونويسي | 19 |
| 5-2-3-1- سيگنالهاي ترجمه يكي از عوامل مؤثر در افزايش بيان | 19 |
| 6-2-3-1- انتخاب كدون | 20 |
| 4-1- مسائلي در مورد توليد پروتئينهاي نوترکيب در اشرشياکلي | 21 |
| 1-4-1- پايداري پلاسميد | 21 |
| 2-4-1- عدم حذف متيونين در انتهاي N ترمينال پروتئين نوترکيب | 22 |
| 3-4-1- بار متابوليکي | 23 |
| 4-4-1- مشکلات بيان پروتئينهاي نوترکيب در سيتوپلاسم باکتري اشرشياکلی. | 23 |
| 5-1- سيستم ایمنی ذاتی و اكتسابي | 25 |
| 6-1- سایتوکاینها | 25 |
| 1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF) | 26 |
| 1-1-6-1- ويژگيهاي ژن و مولكول TNFα | 27 |
| 2-1-6-1- ويژگي هاي ساختاري پروتئين TNF | 28 |
| 3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفاميلي آنها | 29 |
| 4-1-6-1- نقش بيولوژيكي TNFα | 31 |
| 5-1-6-1- مكانيسم عمل | 31 |
| 7-1- TNF-α و نقش آن در برخي از بيماريهای تحلیل عصبي | 34 |
| 1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD) | 34 |
| 2-7-1- TNF و ایسکمی مغزي | 35 |
| 3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون | 36 |
| دستگاههاي مورد استفاده | |
| فصل دوم : مواد و روشها | |
| 1-2- نمونهگيري از خون انسان | 38 |
| 2-2- استخراج RNAي كل از خون | 38 |
| 1-2-2- وسايل لازم | 38 |
| 2-2-2- روش کار | 39 |
| 3-2- سنتز cDNA | 40 |
| 1-3-2- روش کار | 41 |
| 4-2- کلونینگ cDNA ی کد کننده TNF-αی انسان | 41 |
| 1-4-2- طراحی جفت پرایمرها | 41 |
| 2-4-2- واکنش PCR | 42 |
| 1-2-4-2- الكتروفورز با ژل آگاروز | 43 |
| 1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز | 43 |
| 2-1-2-4-2- روش کار | 43 |
| 3-1-2-4-2- رنگآميزي ژل آگارز با اتيديوم برومايد | 43 |
| 3-4-2- خالصسازی محصول PCR با استفاده از كيت | 44 |
| 4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322 | 45 |
| 1-4-4-2- انجام واکنش اتصال | 47 |
| 2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری | 47 |
| 3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli | 47 |
| 4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتریها | 48 |
| 5-4-4-2- تهيه باكتريهاي مستعد (Competent bacteria) براي پذيرش DNA پلاسميدي خارجي | 49 |
| 6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلولهای مستعد باکتریایی | 50 |
| 7-4-4-2- غربال كردن كلون‌هاي واجد پلاسميد نوتركيب و کشت کلونی باکتریایي. | 50 |
| 8-4-4-2- استخراج DNA پلاسميدي نوترکیب | 51 |
| 9-4-4-2- تایید کلنیهای حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیمهای برشی | 51 |
| 5-4-2- كلونينگ cDNی كدكننده TNF-α در حامل pET21 | 52 |
| 1-5-4-2- برش حامل pET21 | 52 |
| 2-5-4-2- اتصال cDNAی TNF-α به حامل pET21 | 54 |
| 6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باكتريE.coli سویه BL21(DH3) برای بررسی پروتئین نوترکیب | 54 |
| 1-6-4-2- انتخاب کلونهاي ترانسفورم شده و کشت کلنیها | 54 |
| 5-2- روشهای مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نوترکیب | 55 |
| 1-5-2- القاء بیان پروتئین نوترکیب | 55 |
| 2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE | 55 |
| 1-2-5-2- SDS-PAGE | 56 |
| 2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE | 57 |
| 3-2-5-2- روش آزمایش | 57 |
| 3-5-2- وسترن بلاتينگ | 59 |
| 6-2- نرمافزارها | 61 |
| فصل سوم : نتایج | |
| 1-3- نمونههای خون | 62 |
| 2-3- استخراج RNA کل از خون | 62 |
| 3-3- سنتز cDNA كل | 63 |
| 1-3-3- تکثیر توالی کدکننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی | 63 |
| 4-3- کلونسازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نوترکیب pBRtnf |
64 |
| 5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نوترکیب pET21tnf | 67 |
| 6-3- بررسی بیان پروتئین نوترکیب در E. coli | 71 |
| 7-3- مقایسه اثر غلظتهای مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین | 72 |
| 8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمانهای مختلف بعد از القاء | 73 |
| 9-3- وسترن بلاتینگ | 74 |
| فصل چهارم : بحث | |
| 4-1- بحث | 75 |
| فصل پنجم : نتیجهگیری و پیشنهادات | |
| نتیجهگیری و پیشنهادات | 80 |
| منابع مورد استفاده | 81 |
فهرست جداول |
| جدول 1-1 : برخی از پروتئینهای نوترکیب موجود در بازار دارویی………………………..3 |
| جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستمهای بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئینهای نوترکیب…….12 |
| جدول 3-1 : تعدادي از پروموترهاي مورد استفاده براي بيان ژن در E. coli…………..17 |
| جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA…………………………………………………40 |
| جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادير بر حسب ميكروليتر)……………………………..42 |
| جدول 3-2 : واکنش برش آنزيمي………………………………………………………………………46 |
| جدول 4-2 : ترکیبات واکنش اتصال TNF-αو pBR322………………………………..47 |
| جدول 5-2 : فهرست سويه‌هاي E. coli استفاده شده در اين تحقيق……………………..47 |
| جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB……………………………………………………………..48 |
| جدول 7-2 : مخلوط واكنش براي برش آنزيمي……………………………………………………54 |
| جدول 8-2 : اجزاي واكنش اتصال……………………………………………………………………..54 |
| جدول 9-2 : تهیه 12 میلیلیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد………………………57 |
| جدول 10-2 : تهیه 5 میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد………………………….57 |
| جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x)……………………………………………………………..57 |
| جدول 12-2 : ترکیبات بافر الکترود (بافر مخازن)…………………………………………………57 |
فهرست اشكال |
| شکل 1-1 : اجزاء اوليه و اصلي وكتور بيانكننده ژن در E. coli………………………………..16 |
| شکل 2-1: نقشه كروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα…………………………………………27 |
| شکل 3-1 : ساختار كريستالي TNFα بر گرفته از Protein Data Bank………………..29 |
| شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1………………………………………………………33 |
| شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)…………………………..46 |
| شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)………………………53 |
| شكل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم………………………………………………………………..62 |
| شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خون با استفاده از کیت……63 |
| شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نوترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز………………………………..64 |
| شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ………………………………………………….65 |
| شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نوترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا……………………………………………………………66 |
| شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نوترکیب بر روی ژل آگارز………67 |
| شكل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf…………………………………………………….68 |
| شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول PCRپلاسمید نوترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………69 |
| شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش يافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI– HindIIIبر روی ژل آگارز…………..70 |
| شکل 10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینهای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نوترکیب به دست آمده، pET21tnf………………………………………………………71 |
| شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21 E. coli………………………………………72 |
| شکل 12-3 : مقایسه غلظتهای مختلف IPTG بر روی بیان……………………………………73 |
| شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمانهای مختلف بعد از القاء…………………………….73 |
| شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظتهای 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلیمولار..74 |
علايم اختصاري:
LB: Luria Bertani
NK cell: Natural killer cell
OD: Optical Density
TNF: Tumor Necrosis Factors
TAE: Tris-acetate EDTA
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis
RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction
rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha
MCS: Multiple cloning site
LPS: Lipopolysaccharide
IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
IL: Interleukin
INF: Interferon
EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid
DW: Distilled water
APS: Ammonium persulfate
MS: Multiple Sclerosis
TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine or N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,2-diaminoethan
TE: Tris EDTA
TM: Melting temperature
RCLB: Red Cell Lysis Buffer
CTL : Cytotoxic T cell
X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside
MHC: Major Histocompatibility Complex
AD: Alzheimer’s disease
PD: Parkinson’s disease
LT: Lymphotoxin
TLR: Toll-like receptor
FADD: Fas-Associated protein with Death Domain
RIP: Receptor Interacting Protein
راهنمای خرید و دانلود فایل
برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.
بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.
در صورت بروز هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.
برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایید.
ديدگاه ها