بررسی تغیر بیان ژنهایLTP و SOS1 درپاسخ به تنش شوری در ارقام مختلف گندم نان وخویشاوند وحشی آن : پایان نامه ارشد کشاورزی
کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” بررسی تغیر بیان ژنهایLTP (پروتئین انتقال دهنده چربی)وSOS1 (آنتی پورتر Na+/H+ ) درپاسخ به تنش شوری در ارقام مختلف گندم نان وخویشاوند وحشی آن ” با گرایش بیوتکنولوژی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.
چکیده پایان نامه بررسی تغیر بیان ژنهایLTP (پروتئین انتقال دهنده چربی)وSOS1 (آنتی پورتر Na+/H+ ) درپاسخ به تنش شوری در ارقام مختلف گندم نان وخویشاوند وحشی آن:
شوری یکی از مهمترین تنش های غیر زیستی در گیاهان زراعی است. سطوح بالای سدیم سمی و مخالف تأثیر روند متابولیسم سلولی و تعادل یونی است. البته وجود مقادیر کم سدیم در سلول برای رشد گیاه حیاتی است. ژن مقاومت به شوری SOS1، آنتی پورتر Na+/H+غشای پلاسمایی را در گندم Triticum aestivumرمز می نماید. cDNA آن 3429 نوکلئوتید طول دارد که یک پلی پپتید با 1142 اسید آمینه و وزن 126 کیلو دالتون را رمز می نماید. یکی دیگر از ژن های موثر در مقاومت به شوری ژن LTP است. به نظر می رسد که ژن LTP هنگام تنش شوری در انتقال برون سلولی لیپیدها برای تولید واکس کوتیکولی برگ نقش آفرینی می کند.
انواع پروتئین های LTP گیاهی دارای تعداد اسیدهای آمینه های مختلف از 91 تا 95 هستند. فاقد تریپتوفان بوده و دارای هشت باقیمانده سیستئین در موقعیت حفاظت شده هستند.LTP ها در انجام بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی شامل تنظیم فعالیت ساختن پکتین، رسوب مواد در دیواره دانه گرده در حال توسعه، تشکیل موانع ساختاری و تحریک مسیر پیام رسانی سیستمیک و رویان زایی از سلول های رویشی نقش دارند. LTPها پروتئین های حدود 9 کیلو دالتونی هستند که به مقادیر زیاد (حدود 4% از کل پروتئین های محلول) در گیاهان عالی یافت می شوند. در این پژوهش به منظور بررسی سطح بیان ژن های LTPو SOS1 آغازگرهای forward وreverse درNCBI طراحی شدند. بذرهای گندم الموت (ژنوتیپ حساس)، ارگ (ژنوتیپ متحمل) و آجیلوپس (ژنوتیپ وحشی) کشت شده در محیط کشت هیدروپونیک، تحت تنش NaClبا غلظت 150 میلی مولار قرار گرفتند و سپس در زمان های صفر، 3، 6 و 24 ساعت پس از تنش نمونه گیری انجام شد.
به منظور دقت در کار دو ظرف به عنوان شاهد در نظر گرفته شد که در هر بار نمونه برداری در ساعت های مشخص از ظرف های شاهد هم نمونه برداری انجام شد. سپس بررسی بیان با استفاده از Real Time PCRانجام شد. بررسی بیانژن SOS1درتنش شوری ثابت کردکه باافزایش زمان در غلظت 150 .با مقایسه میزان بیان ژن LTP بین بافت های برگ و ریشه ارقام الموت ، ارگ و ژنوتیپ آجیلوپس میتوان گفت که بیشترین میزان بیان در برگ آجیلوپس در 6 ساعت و در ریشه آجیلوپس در 3 ساعت بعد از تنش وجود داشته است و در تمام موارد تفاوت معنی داری بین برگ و ریشه آنها وجود دارد. همچنین، با مقایسه بین ارقام حساس( الموت ) و مقاوم( ارگ ) و ژنوتیپ وحشی( آجیلوپس ) می توان گفت که رقم مقاوم ارگ دربیانژنLTP عکسالعمل بهتری نسبت به رقم حساس الموت نشانداده است درنتیجه این مکانیسم درایجادمقاومت دررقم مقاوم مفیدتراست.
همچنین مشخص شد که ژن LTPدر ایجاد مقاومت به شوری در گیاهان نقش دارد. بعلاوه مقایسه میزان بیان ژن SOS1بین برگ و ریشه در ارقام الموت و ارگ و آجیلوپس نشان داد که در اینجا نیز تفاوت معنی داری بین برگ و ریشه در هر ساعت بعد از تنش وجود دارد که این تفاوت تنها در 24 ساعت بعد از تنش در برگ و ریشه ارگ معنی دار نبود.
تنش شوری
افزایش نمک باعث سمیت یون درون سلول می شود. غلظت های بالای نمک در محیط ریشه تنش های فوق اسمزی بوجود می آورد که از جذب و انتقال آب جلوگیری می کند. تنش های ثانویه مانند عدم تعادل غذایی و اکسیداسیون، اغلب در اثر سمیت یون و تنش فوق اسمزی رخ می دهند)(Zhu,2001.گیاهان با تغییر الگوی بیان ژن، فعالیت متابولیکی و انتقال یون و آب برای کاهش آسیب تنش و هموستازی دوباره یون و آب پاسخ می دهند(Gaxiola et al.,1999).که دارای اهمیت بحرانی برای گیاه به تنش شوری می- باشد(Hasegawa et al.,2000). انتقال دهنده های یونی مختلفی تعیین کننده میزان نهایی هموستازی یونی هستند که قویاً در سطح رونویسی و بعد از رونویسی تنظیم میشوند. گیاهان تحت شرایط فیزیولوژیکی ایده آل، به طور نسبی غلظت زیاد K+و غلظت کم Na+ را در سیتوزول سلول های خود نگه می دارند.(Binoza,1988) این میزان بالایK+به Na+ را در سیتوزولی از برداشت K+نسبت به Na+، عدم جذب Na+ و انتقال Na+به درون واکوئل نتیجه می شود. با توجه به موقعیت جغرافیایی ایران وسعت 25 میلیون هکتار اراضی تحت تأثیر نمک که معادل 15 درصد تمام سطح کشور است (Kamkar et al.,2004)ضرورت شناخت کامل این بخش، به خوبی احساس می شود. در حال حاضر استفاده از ارقام مقاوم به شوری یکی از مهترین روش های موثر در بهره برداری و افزایش عملکرد در زمین های شور و نسبتاً شور نواحی خشک و نیمه خشک جهان به حساب می آید (جعفری و همکاران، 1387).
شوری و خشکی از مهمترین و موثرترین تنش ها می باشند (Bohnert et al.,1995).تخمین زده شده است که بیش از 20 درصد زمین های قابل کشت کره زمین حاوی سطوح بالای نمک است که باعث تنش شوری بر گیاهان زراعی می شود و یک مشکل مهم مناطق خشک و نیمه خشک جهان است(Flowers,1995).
غلظت زیاد نمک ها با کاهش پتانسیل اسمزی محلول خاک، سمیت یون ها، به هم زدن مقادیر یون ها و با ایجاد کمبود عناصر ضروری به گیاه صدمه می زنند (Greenway et al.,1980).
ایران کشوری است که به دلیل متوسط نزولات جوی پایین در منطقه خشک و نیمه خشک جهان قرار دارد. کمبود آب آبیاری و شور بودن آب اکثر مناطق و زمین های کشاورزی که هم اکنون جزو عوامل محدود کننده اصلی تولید محصولات زراعی در ایران می باشند، در آینده نزدیک مشکلات بیشتری ایجاد خواهد کرد. در آینده ای نه چندان دور، بحران آب قسمت های وسیعی از کشور را به صورت جدی تهدید خواهد کرد. با افزایش روز افزون جمعیت، نیاز به واردات محصولات زراعی جهت تأمین غذای مورد نیاز مردم بیشتر خواهد شد بنابراین بایستی راهکارهایی برای تأمین امنیت غذایی و راه های افزایش عملکرد و منابع غذایی جدید اندیشیده شود. خوشبختانه ایران یکی از منابع تنوع در تعدادی از محصولات زراعی می باشد(جعفری و همکاران، 1387).
امروزه مهندسی ژنتیک امکان ایجاد واریتهها و گیاهانی را فراهم میکند که دارای صفات جدیدی بوده و تولید آنها از روش های معمول غیر ممکن است. از جمله این صفات، صفات مقاومت به تنش های زیستی و غیره زیستیهستند که توجه محققین را به خود جلب کرده اند. انتقال همزمان چند ژن موثر در مقاومت یکی از راه های ایجاد مقاومت می باشد اما دارای محدودیت های خاصی است. بنابر این می توان مقاومت خوبی را نسبت به طیف وسیعی از انواع تنش های زیستی و غیر زیستی ایجاد کرد. از جمله این ژن ها می توان به[1]sos1 و[2]LTP اشاره کرد.
اهداف پژوهش
1- بررسی سطح بیان ژنهایLTPوSOS1
2- اندازه گیری میزان فعالیت دو آنزیم پراکسیداز(POD[4]) و کاتالاز(CAT[5]).
[1]آنتی پور یا تبادل گر دوسویه Na+/H+غشاء پلاسمایی
[2]پروتئین انتقال دهنده لیپید
[3]- Basal Metabolic Rate (BMR)
[4] Peroxidase
[5]Catalase
فهرست مطالب
فصل اول: مقدمه و اهداف 1
1-1-مقدمه 2
1-1-1 – تنش شوری 2
1-1-2- اهمیت غلات 3
1-1-3- گیاه شناسی گندم 4
1-1-4-گندم امر 5
1-1-5- معرفی ژن SOS1 5
1-1-6- معرفی ژنLTP 6
1-2- راهکارهای مقابله با شوری در عصر حاضر 7
1-3- اهداف پژوهش 7
فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین 8
2-1- خاک های شور 9
2-2- چگونه شوری برای گیاه مشکل ایجاد می کند 10
2-3- مکانیسم های مقابله با تنش شوری در گیاهان 10
2-4- مکانیسم های مولکولی تحمل به تنش شوری 11
2-5- انواع گیاهان بر اساس واکنش رشد به شوری 11
2-6- ژنهای درگیر در تحمل به تنش شوری 13
2-7- مسیر ژنهای SOSدر تحمل به تنش شوری 14
2-8- شناسایی و نامگذاری ژن LTP 14
2-9- گروه بندی LTP ها 16
2-10- معرفي واکنش Real-time PCR 17
2-11- معرفي روش کمي سنجي مطلق (Absolute Quantification) براي کمي کردن بيان ژن درReal-time PCR 19
2-12-معرفي روش کمي سنجي نسبي Relative Quantification)) براي کمي کردن بيان ژن در Real-time PCR 20
2-13- تعيين راندمان Real-time PCR 20
2-14- کمي کردن نسبي بيان ژن در Real-time PCRبا فرض راندمان100 درصد 23
2-15- کمي کردن نسبي بيان ژن با Real-time PCRدر صورت متغير بودن راندمان يا کمتر از 100 درصد 24
2-16- تاثیر تنششوری بر ویژگیهای بیوشیمیایی 24
فصل سوم: مواد و روش تحقیق 27
3-1- انتخاب ژنوتيپ گندم 28
3-2-تأیید مقاومت رقم ارگ و حساسیت رقم الموت به تنش شوری 28
3-3-کاشت بذر ها 28
3-4- انتخاب نوع محيط کشت مايع 30
3-5- شرايط کنترل شده محيط گلخانه 32
3-6- اعمال تنش شوری با نمک (150 میلی مولار) 32
3-7- نمونه‌گيري از بافت برگي و ریشه 33
3-8- استخراجRNA از بافت برگ و ریشه 33
3-9- تيمار DNAse براي حذف آلودگي ژنومي در RNA استخراج شده 35
3-10- سنتز رشته اول cDNA از RNA 36
3-11- طراحي آغازگرهاي اختصاصي به منظور بررسي بيان ژنهای LTP و SOS1 38
3-12-تکثير cDNAهای سنتز شده با استفاده از آغازگرهای LTP، 18S rRNA وSOS1بوسیله واکنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) 40
3-13- واكنش Real time RT-PCR (Relative)براي cDNA هاي تهيه شده 42
3-14- واكنش Real time RT-PCR ژن LTP وSOS1 و ژنهای كنترل داخلي 18S rRNA 42
3-15- روش نرمال‌سازي بيان ژنهای LTPوSOS1 پس از واكنش Real-time PCR 44
3-16- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) 44
3-17- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) 45
3-18-آنالیز پروموتر ژن های LTP وSOS1 45
فصل چهارم: نتایج و بحث 46
4-1- نتایج 47
4-1-1- استخراج RNA 47
4-1-2- تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده 47
4-1-3-كمي كردن ميزان بيان ژن LTP در شرايط تنش شوری با استفاده از RT-PCRReal time…. 48
4-1-4-كمي كردن ميزان بيان ژنSOS1در شرايط تنش شوری با استفاده ازRT-PCRReal time…… 53
4-1-5- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) 58
4-1-6- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) 62
4-1-7-نتایج آناليز پروموترژنSOS1و LTPدر گیاه برنج 65
4-2- بحث 68
4-2-1- بررسیسطحبیانژنSOS1ونقشآندرسلول 70
4-2-2- بررسیسطحبیانژنLTPونقشآندرسلول 71
4-2-3-تاثیر تنش شوری بر ویژگیهای بیوشیمیایی 73
4-2-4- نتیجه گیریکلی 74
4-3- پیشنهاد ها 75
فصل پنجم: منابع 77
فهرست جداول
جدول 3-1- ترکیبات غذایی محيط کشت مايع هوگلند 31
جدول 3-2- مواد مورد نياز براي تيمار DNAse شرکت فرمنتاز 35
جدول3-3 – نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز cDNA 36
جدول4-3 – نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNAدر مرحله دوم 37
جدول 3-5-اسامي و توالي آغازگرهاي طراحي شده با نرم افزارAlell ID 6و10 Vector NTI به منظور بررسي بيان ژن LTP و SOS1 همچنین دمای اتصال و طول قطعه تکثیر شده 39
جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش زنجيره اي پليمراز 40
جدول 3-7- چرخه حرارتي واکنش زنجيره‌اي پليمراز و دماي اتصال با توجه به نوع پرايمر مورد استفاده تعيين شد که در جدول زیر آمده است 41
جدول 3-8 – سيكل گرمايي استفاده شده در واكنش Real-time PCR ژن اصلي LTP وSOS1 وكنترل داخلي 18srRNA 43
جدول 3-9 – نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واكنش Real-time PCRبراي ژنهای اصلي LTP وSOS1و ژن كنترلي داخلي 18srRNA 43
جدول4 -1- میزان آنزیم پر اکسیداز در ریشه و برگ ارقام آجیلوپس، ارگ و الموت تحت تنش شوری
150 mM 58
جدول 4 -2 – میزان خطای محاسبه شده در ریشه و برگ ارقام آجیلوپس،ارگ و الموت تحت تنش شوری
150mM 58
جدول4-3 – میزان آنزیم کاتالاز در ریشه و برگ ارقام آجیل وپس، ارگ و الموت تحت تنش شوری
150 mM 62
جدول4 -4 -میزان خطای محاسبه شده در ریشه و برگ ارقام آجیلوپس،ارگ و الموت تحت تنش شوری
150 mM 62
جدول 4 -5- مهمترین موتیف های عمومی و اختصاصی احتمالی موجود در پروموتر ژنSOS1در گیاه برنج که از سایت هایPhytozome وPlantcare استفاده شد 66
جدول4 -6 – مهمترین موتیف های عمومی و اختصاصی موجود در پروموتر ژن LTP در گیاه برنج………… 66
راهنمای خرید و دانلود فایل
برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.
بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.
در صورت بروز هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.
برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایید.
ديدگاه ها