توليد موتاسيون در گياه نعناع فلفلی با استفاده از موتاژن EMS : پایان نامه ارشد کشاورزی بیوتکنولوژی
کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” توليد موتاسيون در گياه نعناع فلفلی با استفاده از موتاژن EMS ” با گرایش بیوتکنولوژی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.
چکیده توليد موتاسيون در گياه نعناع فلفلی با استفاده از موتاژن EMS:
نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperitaیکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. استفاده از مواد موتاسیون‌زا از قبیل EMS میتواند تغییرات جهش‌زای نقطهای در گیاه ایجاد کند که در نهایت منجر به ظهور فنوتیپ جدید در این گیاه با ارزش شوید. لذا این پژوهش با انجام تیمارهای متعدد از غلظت‌های مختلف EMS روی سرشاخه‌های رشد یافته در محیط کشت MS بدون هورمون و با غلظت‌های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% از EMS و مدت زمان‌های مختلف (24 و48 ساعت) و همچنین در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد. ارزیابی در داخل لوله آزمایش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه‌ها در شرایط in vitro، تیمارها با ماده جهش‌زا اتیل متان سولفانات مورد بررسی قرار گرفتند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیکی از قبیل طول ساقه و تعداد ریشه رونده جانبی در سطح 1% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح 5% پاسخ معنی‌داری را نشان دادند. نتایج اين پژوهش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر فنوتیپی این گیاه دارویی دارد. غلظت 01/0% EMS بهترین نتیجه معنی‌دار را در سطح 1% و از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند به‌دست آورده که برروی خصوصیاتی همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبی اثر داشت. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متان سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.
مقدمه:
گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و میتوان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).
در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ها متعدد می‌باشد که از آن جمله میتوان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).
یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی[1] است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.
استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی در این زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند. در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‌های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی[2] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها میتوان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته[3] و پلی پلوئید[4] را نام برد.
گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ها از جمله نعناع فلفلی دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با استفاده از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای[5] و یا کشت استریل نیز مطرح میشود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب‌بیگی و همکاران، 1385؛ سونانداکوماری و همکاران[6]، 2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[7] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری[8]، 1994).
اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش‌های وی روی کشت تک سلول‌ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[9]، 1902). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر میتواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه نعناع فلفلی نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متان سولفانات[10] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.
اهمیت موضوع
برای انجام کشت بافت نعناع فلفلی (Mentha piperita) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران[11]، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول‌های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).
نعناع فلفلی به عنوان یک گیاه دارویی شناخته میشود (امیدبیگی، 1384،1389). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره نعناع فلفلی صورت گرفته است (کاظم الوندی و شریفان، 1388). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. با توجه به اینکه تکثیر این گیاه از طریق بذر مشکل است (بدلیل بذور کم و نابارور)، بهترین و سریع‌ترین راه برای داشتن گیاه جهت مصارف صنعتی، کشت بافت است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت و بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف برای این گیاه ضرورت دارد.
فرضیات
1- کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه نعناع فلفلی می‌باشد.
2- نعناع فلفلی در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.
3- ایجاد جهش نقطهای تا چه میزانی میتواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.
اهداف پژوهش
1- آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی نعناع فلفلی و تکثیر آن در داخل شیشه.
2- بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطهای در نعناع فلفلی.
3- بررسی تغییر در میزان مواد موثره گیاه در غلظت‌های مختلف ماده جهش‌زای EMS
فهرست مطالب | |
| 1 | چکیده |
| فصل اول: مقدمه و کلیات | |
| 2 | 1-1 مقدمه |
| 3 | 1-1-1 اهمیت موضوع |
| 4 | 1-1-2 فرضیات |
| 4 | 1-1-3 اهداف پژوهش |
| 5 | 1-2 کلیات |
| 5 | 1-2-1 گیاه شناسی |
| 6 | 1-2-2 نیازهای اکولوژی |
| 6 | 1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار |
| 7 | 1-2-4 خواص دارویی |
| 7 | 1-2-5 موارد استفاده |
| 8 | 1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس |
| 8 | 1-2-7 کشت بافت |
| 9 | 1-2-7-1 انواع کشت بافت گیاهی |
| 10 | 1-2-7-2 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت |
| 10 | 1-2-7-3 نمک‌های غیرآلی |
| 11 | 1-2-7-4 ویتامین‌ها |
| 11 | 1-2-7-5 منبع انرژی |
| 11 | 1-2-7-6 میواینوسیتول |
| 12 | 1-2-7-7 عوامل فیزیکی |
| 12 | 1-2-7-8 ریزنمونه |
| 12 | 1-2-7-9 چگونگی انتخاب محیط کشت |
| 13 | 1-2-7-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت |
| 13 | 1-2-7-11ریشه‌زائی |
| 14 | 1-2-8 تعریف موتاسیون (جهش) |
| صفحه | عنوان |
| 14 | 1-2-8-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون |
| 15 | 1-2-8-2 سطوح ایجاد موتاسیون |
| 15 | 1-2-8-3 انواع موتاسیون |
| 16 | 1-2-8-4 موتاژن (عامل جهش‌زا) |
| 16 | 1-2-8-4-1 انواع موتاژن |
| 16 | 1-2-8-4-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا |
| 18 | 1-2-8-4-3 مواد گیاهی مورد تیمار |
| 18 | 1-2-8-4-4 اصلاح به روش موتاسیون |
| 19 | 1-2-8-4-5 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات. |
| 19 | 1-2-8-4-6 موفقیت موتاسیون |
| 19 | 1-2-8-4-7 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون |
| 20 | 1-2-8-4-8 هدف موتاسیون مصنوعی |
| 21 | 1-2-9 روغن‌های اسانس |
| 22 | 1-2-9-1 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه |
| فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده | |
| 23 | 2-1 کشت بافت |
| 24 | 2-2 اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف |
| 26 | 2-3 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف |
| فصل سوم: مواد و روش‌ها | |
| 32 | 3-1 مواد گیاهی |
| 32 | 3-2 کشت بافت |
| 32 | 3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت |
| 33 | 3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو |
| 34 | 3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو |
| 34 | 3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم |
| 35 | 3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین |
| 35 | 3-2-2 تهیه محیط کشت |
| صفحه | عنوان |
| 36 | 3-2-3 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی |
| 36 | 3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه |
| 37 | 3-2-4 تهیه ریزنمونه |
| 37 | 3-2-5 بهینه سازی محیط کشت |
| 37 | 3-2-6 بررسی نمونه‌های کشت شده |
| 38 | 3-2-7 تیمارهای مورد استفاده |
| 38 | 3-2-7-1 روش تهیه استوک EMS |
| 39 | 3-2-7-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی |
| 39 | 3-2-7-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه |
| 39 | 3-2-7-4 روش شستشوی تیمارها |
| 40 | 3-3 استخراج مواد موثره گیاهی |
| 40 | 3-3-1 روش‌های استخراج اسانس |
| 40 | 3-4 آنالیز اجزاء اسانس |
| 41 | 3-5 آنالیزهای آماری |
| فصل چهارم: نتایج و بحث | |
| 42 | 4-1 بررسی نمونه‌های کشت بافتی |
| 45 | 4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه |
| 46 | 4-2-1 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه |
| 47 | 4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه |
| 47 | 4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ |
| 48 | 4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی |
| 49 | 4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه |
| 50 | 4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ |
| 51 | 4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه |
| 51 | 4-3 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی |
| 52 | 4-4 استخراج اسانس |
| 52 | 4-4-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس |
| صفحه | عنوان |
| 53 | 4-4-2 نتایج آزمایشگاهی |
| 53 | 4-4-3 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه |
| 54 | 4-4-4 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس |
| فصل پنجم: نتیجه‌گیری | |
| 55 | 5-1 بحث |
| 55 | 5-1-1 کشت بافت گیاهی |
| 56 | 5-1-2 اثرات موتاژن EMS |
| 60 | 5-2 نتیجه‌گیری |
| 61 | 5-3 پیشنهادات |
| 62 | فهرست منابع فارسی |
| 64 | فهرست منابع انگلیسی |
| 71 | پیوست‌ها |
| 75 | چکیده انگلیسی |
فهرست جداول | |
| 33 | جدول 3-1 ترکیبات محیط کشت پایه MS |
| 34 | جدول 3-2 جدول عناصر پرمصرف MS با غلظت X10 |
| 34 | جدول 3-3 جدول عناصر کم مصرف MS با غلظت X100 |
| 35 | جدول 3-4 محلول ذخیره آهن، ویتامین و اسیدهای آمینه با غلظت X100 |
| 41 | جدول 3-5 شرایط دستگاه GC-MS |
| 46 | جدول 4-1 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ساقه گیاه نعناع فلفلی… |
| 47 | جدول 4-2 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ریشه گیاه نعناع فلفلی.. |
| 47 | جدول 4-3 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد برگ در ساقه گیاه……. |
| 48 | جدول 4-4 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی گیاه……… |
| 49 | جدول 4-5 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد جوانه گیاه |
| 50 | جدول 4-6 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی متوسط طول برگ |
| 51 | جدول 4-7 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه گیاه |
| 52 | جدول 4-8 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی در گیاه نعناع فلفلی…… |
| 53 | جدول 4-9 درصد اسانس و روش استخراج |
| 54 | جدول 4-10 میزان مواد موثره موجود در اسانس نعناع فلفلی |
فهرست شکل‌ها و پیوست‌ها | |
| صفحه | عنوان شکل |
| 5 | شکل 1-1 شمائی از گیاه کامل نعناع فلفلی |
| 17 | شکل 1-2 ساختار شیمیایی مواد جهش‌زا |
| 53 | شکل 4-1 کروماتوگرام گازی اسانس نعناع فلفلی |
| 58 | شکل 5-1 نمای از مراحل تاثیر EMS برروی گیاه کشت بافتی |
| 59 | شکل 5-2 مراحل رشد گیاهان مورد تیمار موتاژن در محیط کشت |
| 59 | شکل 5-3 تیمار اعمال شده در مزرعه |
| 71 | شکل الف-1 مراحل ضدعفونی گیاه |
| 71 | شکل الف-2 تهیه ریزنمونه |
| 72 | شکل الف-3 مراحل انجام کار در اتاقک کشت |
| 72 | شکل الف-4 نمای از دستگاه انکوباتور |
| 72 | شکل الف-5 اعمال EMS در محیط کشت |
| 75 | شکل الف-6 اعمال EMS در مزرعه |
| 73 | شکل الف-7 شستشوی تیمارهای کشت بافتی از EMS |
| 73 | شکل الف-8 شستشوی بوته‌های تیمار شده در مزرعه |
| 74 | شکل الف-9 نمای از بوته‌های تیمار شده در مزرعه |
| 74 | شکل الف-10 مراحل اسانس‌گیری |
| 74 | شکل الف-11 نمای از دستگاه روتاری |
فهرست نمودارها | |
| صفحه | عنوان نمودار |
| 42 | نمودار4-1 طول ساقه |
| 43 | نمودار4-2 طول ریشه |
| 43 | نمودار4-3 تعداد برگ در ساقه |
| 44 | نمودار4-4 تعداد ریشه جانبی |
| 44 | نمودار4-5 تعداد جوانه در ساقه |
| 45 | نمودار4-6 متوسط طول |
| 46 | نمودار4-7 اثر غلظت EMS برروی طول برگ در گیاه نعناع فلفلی |
| 48 | نمودار4-8 اثر غلظت EMS برروی تعداد برگ در ساقه گیاه نعناع فلفلی |
| 49 | نمودار4-9 اثر غلظت EMS برروی تعداد ریشه جانبی گیاه نعناع فلفلی |
| 50 | نمودار4-10 اثر غلظت EMS برروی تعداد جوانه گیاه نعناع فلفلی |
فهرست علامت‌ها و اختصارها
| معادل فارسی | معادل انگلیسی | علامت |
| اتیل متیل سولفانات | Ethyl Methane Sulfonate | EMS |
| کروماتوگرافی گازی توام با طیف سنجی جرمی | Gas Chromatography Mass Spectroscopy | GC-MS |
| اتیل اتان سولفانات | Ethyl Ethane Sulfonate | EES |
| بنزیل آدنین | Benzyladenine | BA |
| بنزیل آمینوپورین | Benzylaminopurine | BAP |
| ایندول-3- استیک اسید | Indole3-acetic acid | IAA |
| ایندول-3- بوتیریک اسید | Indole3-butric acid | IBA |
| نفتالین استیک اسید | 1-Naphthaleneacetic acid | NAA |
راهنمای خرید و دانلود فایل
برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.
بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.
در صورت بروز هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.
برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود کلیک نمایید.
ديدگاه ها