DOC

doc

تعداد صفحات : 131

پایان نامه کارشناسی ارشد

رشته کشاورزی - گرایش بیوتکنولوژی

همراه با جداول ، اشکال و نمودار

79000 تومان

بررسی جنین‌زایی سوماتیکی در نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) : پایان نامه ارشد کشاورزی بیوتکنولوژی

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” بررسی جنین‌زایی سوماتیکی در نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) ” با گرایش بیوتکنولوژی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده بررسی جنین‌زایی سوماتیکی در نخل خرما (Phoenix dactylifera L.):

نخل خرما گیاهی تک‌لپه، دوپایه و متعلق به خانواده Arecaceae است. به منظور غلبه بر مشکلات تکثیر رویشی و روش‌های معمول ازدیاد از طریق بذر، ریز‌ازدیادی از طریق کشت بافت مورد توجه‌ قرار گرفته است. هدف از این تحقیق، بررسی امکان کالوس‌زایی و جنین‌زایی سوماتیکی در نخل خرما با استفاده از ریزنمونه‌های مختلف می‌باشد. آزمایشات انجام شده در آزمایشگاه بیوتکنو‌لوژی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان در سال 93-92 انجام گرفت. بدین‌منظور، ریزازدیادی با استفاده از ریزنمونه‌های مختلف شامل برگ بالغ و نارس، میوه نارس، بذر نارس، آندوسپرم، پریکارپ میوه نارس، بساک و میکروسپور در محیط‌های کشت مختلف صورت گرفت. کشت برگ رقم خضراوی در محیط کشت حاوی غلظت‌های مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد، 2,4-D، BAP و TDZ نشان داد که بیشترین میزان کالوس‌زایی زمانی بدست‌ می‌آید که هر سه تنظیم‌کننده رشد در محیط کشت حضور داشته باشند. در 20 ترکیب تیماری‌ اعمال‌شده، ترکیب تیماری حاوی 5 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D، 2 میلی‌گرم در لیتر BAP و 4 میلی‌گرم در لیترTDZ ، در لبه‌ی خارجی ریزنمونه‌های برگی و در ترکیب تیماری حاوی 5 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D، 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 4 میلی‌گرم در لیتر TDZ در کناره‌های رگبرگ ریزنمونه، کالوس تشکیل گردید.

با استفاده از ریزنمونه میوه نارس در محیط کشت مشابه، مشخص شد زمانی که دو تنظیم‌‌کننده رشد TDZ و 2,4-D به مقدار 5 میلی‌گرم در لیتر در محیط کشت حضور داشته باشند بعد از سه هفته کالوس و بعد یک هفته چندین جنین بر روی این کالوس‌ها تشکیل می‌شود. کشت ریزنمونه‌های آندوسپرم به همراه جنین و پریکارپ در محیط کشت مشابه نیز نشان داد که حضور 2,4-D و TDZ به مقدار 5 میلی‌گرم در لیتر برای کالوس‌زایی مفید بوده است.

همچنین در کشت آندوسپرم به همراه جنین، جنین‌ها رشد یافته و ابتدا ریشه‌چه و بعد از طی سه ماه ساقه‌چه مشاهده گردید. در آزمایش بررسی اکسین‌های مختلف IAA،IBA ، 2,4-D و NAA بر کالوس‌زایی از ریز‌نمونه‌ی برگ رقم استعمران، نتایج نشان داد که ریز‌نمونه‌های قرار گرفته در محیط کشت حاوی NAA به مراتب کالوس‌زایی بهتری داشته است.

همچنین کشت آندوسپرم و کشت پریکارپ میوه نیز در این محیط کشت حاوی اکسین‌های مختلف صورت گرفت اما هیچ واکنشی مشاهده نشد و ریز‌نمونه‌ها قهوه‌ای شده و از بین رفتند. همچنین در آزمایشی که به منظور بررسی امکان آندروژنز در خرما صورت گرفت نتایج نشان داد که در کشت بساک تحت ترکیب تیماری غلظت‌های مختلف کلشی‌سین به مدت زمان‌های مختلف، غلظت و مدت زمان‌ قرار‌گیری بساک‌ها در محیط حاوی کلشی‌سین بر میزان کالوس‌زایی تاثیر معنی‌داری داشت و در غلظت500 میلی‌گرم در لیتر و مدت زمان 12 ساعت بالاترین میزان کالوس‌زایی و در همین غلظت و مدت زمان 36 ساعت جنین‌زایی مستقیم به مقدار محدودی رخ داد. در آزمایش دیگری، کشت بساک در محیط‌های کشت MS و Y₃ با ظهور نقاط سفید رنگ بر روی بساک همراه بود و 2 ماه بعد از کشت این نقاط سفید رنگ متورم شدند اما این واکنش‌ها پیشرفت چندانی پیدا نکردند. همچنین کشت میکروسپور‌ خرما نیز صورت گرفت اما تا دو ماه بعد از کشت تغییرات قابل توجهی مشاهده نگردید.

نخل خرما[1] (Phoenix dactylifera L.) گیاهی دیپلوئید (2n = 36)، چند ساله[2]، تک‌لپه[3]، دو‌پایه[4]، دگرگشن[5] و همیشه سبز[6] بلند است که متعلق به خانواده آراکاسه[7] می‌باشد (اسلام و همکاران[8]، 2011). این خانواده ۲۰۰ جنس و 2۵۰۰ گونه دارد (فاو[9]، 2008). نخل خرما به دلیل سازگاری و تحمل طبیعی بالا با شرایط نامساعد محیطی از قبیل خشکی، شوری و درجه حرارت بالا نقش اقتصادی و اجتماعی مهمی در مناطق بیابانی خاور‌میانه و شمال آفریقا را داراست (باکیت و همکاران[10]، 2008). به طوری که تقریباً 95 درصد از خرمای تولیدی کل جهان در خاور‌میانه تولید می‌شود (اسلام و همکاران، 2011).

براساس شواهد باستان شناسی قدمت کشت نخل خرما در ایران بیش از هفت هزار سال پیش می‌رسد که از بین‌النهرین منشاء گرفته است (وریگلی[11]، 1995). تعداد کل درختان نخل در جهان 105 میلیون و مساحتی حدود 800 هزار هکتار را می‌پوشاند (جین[12]، 2007). در حال حاضر خرما در پنج قاره دنیا و در بیش از ۳۴ کشور کشت و مورد بهره‌برداری قرار می‌گیرد. بیش از نیمی از خاک کشور ایران مستعد کشت و پرورش خرما می‌باشد.

در حال حاضر، 21 درصد خرمای جهان از ایران تأمین می‌شود. در سال 1388، ایران با حدود 253 هزار هکتار سطح زیر کشت و با تولیدی بالغ بر 105400 تن، از بزرگ‌ترین تولید‌کنندگان خرما در دنیا بوده است و از نظر سطح زیر کشت بعد از امارات متحده عربی و از نظر تولید بعد از کشور مصر در رتبه دوم جهانی قرار داشت (فاو، 2009) که از این سطح 84 درصد را درختان بارور و 16 درصد را درختان غیر بارور یا نهال تشکیل می‌دهند.

ضرورت و اهمیت موضوع

در جنین‌زایی سوماتیکی انتخاب منبع ریز‌نمونه حساس‌ترین تصمیم بوده است، لذا از منابع مختلف گزارش‌های متعددی منتشر شده است. تلاش‌های اولیه از طریق رویان‌های تخم (شروئیدر[13]، 1970) بوده و بعد‌ها ریزنمونه‌هایی از قبیل رأس ساقه، برگ‌های اولیه‌، جوانه‌ی‌ جانبی، برگ‌های جوان و گل آذین مورد بررسی قرار گرفته است. در بسیاری از آزمایشگاه‌های تجاری، نخل خرما با جنین‌زایی از ریز‌نمونه رأس ساقه تولید می‌گردد که استفاده از این ریزنمونه‌ و استفاده از محیط‌های با اکسین بالا باعث بسیاری از مشکلات تکنیکی از جمله آلودگی‌های درون‌زای باکتریایی، قهوه‌ای شدن، تنوع سوماکلونال و مدت زمان طولانی جهت تولید (حدود 3 سال) شده است و این در صورتی انجام‌پذیر است که پروتکل شناخته شده‌ای وجود داشته باشد ( ابول ‌سعود[14] و همکاران، 2004).

بنابراین ریزنمونه‌های جایگزین مناسب برای غلبه بر مشکلات ذکر شده در بالا مورد نیاز است. به عنوان مثال در آلودگی‌های باکتریایی میان‌بافتی می‌توان از ریز‌نمونه‌های جوان یا ریز‌نمونه‌های بافت آوندی نابالغ استفاده کرد (افکای[15]، 2005). همچنین استفاده از گل نر و بلاخص بساک‌ها به دلیل هاپلوئید بودن آنها و آلودگی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. با این حال، نرزایی در گونه‌های چوبی[16] تنها در تعداد معدودی موفقیت‌آمیز بوده است (پیکسا و همکاران[17]، 2004). تاکنون نر‌زایی در نخل خرما گزارش نگردیده است و تنها مطالعات کمی بر روی کشت بساک نارگیل انجام گرفته است. از دیگر موارد، کشت جنین است که شامل برداشت جنین استریل از بذر و کاشت آن در یک محیط غذایی استریل است. کشت جنین برای نجات جنین‌ و یا رشد جنین از هیبریداسیون بین‌گونه‌ای[18] (جانستون و استرن[19]، 1957) و کاهش دوره خواب[20] طولانی مورد استفاده قرار می‌گیرد (هودد[21]، 1977). رابشلت و گس[22]، 1974 ریزنمونه‌هایی از جنین خرما را در شرایط درون ‌شیشه‌ای کشت دادند، میوه سبز نخل خرما، دو تا سه ماه بعد از گرده افشانی برداشت شده و در یک محیط غنی شده با 2,4-D کاشته شد، و پس از آن کالوس گره‌دار کرم رنگ به‌دست آمد.

اهداف تحقیق

– تعیین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی[1] مختلف بر جنین‌زایی سوماتیکی در خرما

2- بررسی اثر نوع ریزنمونه بر جنین‌زایی سوماتیکی در خرما

3- بررسی امکان نرزایی در نخل خرما

فهرست مطالب

فصل اول مقدمه و اهداف.. 1

1-1 مقدمه. 2

2-1 بیان مسأله. 3

3-1 ضرورت و اهمیت موضوع. 4

4-1 اهداف تحقیق.. 5

فصل دوم مروری بر پیشینه موضوع. 5

1-2 منشأ و تاریخچه نخل خرما 7

2-2 گسترش جغرافیایی نخل خرما در جهان.. 7

3-2 وضعیت تولید نخل خرما در جهان و ایران.. 9

4-2 گیاه‌شناسی نخل خرما 9

1-4-2 برگ‌ها 9

2-4-2 اندام‌های تولید مثلی.. 9

3-4-2 میوه 11

5-2 تکثیر نخل خرما 12

1-5-2 تکثیر از طریق دانه. 12

2-5-2 تکثیر از طریق پاجوش…. 12

3-5-2 تکثیر از طریق کشت بافت… 13

6-2 عوامل مؤثر بر رشد و نمو ریز‌نمونه. 13

1-6-2 محیط کشت… 14

1-1-6-2 آب… 15

2-1-6-2 عامل ژله‌ای.. 15

3-1-6-2 کربوهیدات‌ها ( منبع کربن و انرژی) 16

4-1-6-2 عناصر معدنی.. 18

5-1-6-2 اسیدیته (pH) 18

6-1-6-2 هورمون‌ها و تنظیم‌کنندهای رشد. 19

1-6-1-6-2 اکسین‌ها 19

2-6-1-6-2 سیتوکینین‌ها 22

7-1-6-2 ویتامین‌ها 23

8-1-6-2 اسید‌های آمینه. 24

9-1-6-2 زغال فعال.. 24

7-2 کشت ریز نمونه. 25

1-7-2 کشت ریز نمونه برگ… 25

2-7-2 کشت ریز نمونه بساک… 26

1-2-7-2 تولید گیاهان هاپلوئید مضاعف… 28

3- 7-2 کشت ریز نمونه جنین.. 31

4-7-2 کشت ریز نمونه گل آذین.. 33

5-7-2 کشت آندوسپرم. 34

فصل سوم مواد و روش‌ها 37

1-3 زمان و محل انجام آزمایش…. 39

2-3 تجهیزات آزمایشگاهی.. 39

1-2-3 تهیه ترکیبات مختلف، محلول‌های پایه و محیط‌های کشت… 39

2-2-3 ابزار و وسایل مورد نیاز برای تهیه و نگه‌داری محیط کشت: 40

3-2-3 اتاق رشد. 40

3-3 تهیه مواد گیاهی.. 41

4-3 محیط کشت… 41

1-4-3 تهیه محیط کشت… 41

2-4-3 تهیه استوک هورمون‌ها 41

5-3 آزمایشات انجام شده 42

1-5-3 آزمایش اول: بررسی تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی از ریز نمونه برگ خرما 42

2-5-3 آزمایش دوم: تأثیر غلظت اکسین‌های مختلف (2,4-D،IAA ، IBA و NAA) بر جنین‌زایی سوماتیکی بر روی ریز نمونه برگ خرما 44

3-5-3 آزمایش سوم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی بساک خرما در محیط کشت MS. 45

4-5-3 آزمایش چهارم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی ریزنمونه بساک خرما در محیط کشت Y₃ مایع.. 46

5-5-3 آزمایش پنجم: بررسی تأثیر غلظت ساکارز بر کشت بساک خرما 47

6-5-3 آزمایش ششم: بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف کلشی‌سین بر روی کشت بساک خرما 48

7-5-3 آزمایش هفتم: کشت میکروسپور 48

8-5-3 آزمایش هشتم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی ریز نمونه میوه نارس خرما 49

6-3 روش‌ها و محاسبات آماری.. 51

فصل چهارم نتایج و بحث… 53

1-4 آزمایش اول: بررسی تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی از ریز‌نمونه برگ رقم خضراوی 53

2-4 آزمایش دوم: تأثیر غلظت‌ اکسین‌های مختلف (2,4-D،IAA ، IBA و NAA) بر جنین‌زایی سوماتیکی بر روی ریز نمونه برگ رقم استعمران 55

3-4 آزمایش سوم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP جنین‌زایی سوماتیکی ریز نمونه بساک خرما در محیط MS 58

4-4 آزمایش چهارم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP جنین‌زایی سوماتیکی ریزنمونه بساک در محیط کشت Y₃ مایع.. 59

5-4 آزمایش پنجم: بررسی میزان غلظت ساکارز بر کشت بساک خرما 61

6-4 آزمایش ششم: بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف کلشی‌سین بر روی کشت بساک… 61

7-4 آزمایش هفتم: کشت میکروسپور 63

8-4 آزمایش هشتم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP جنین‌زایی سوماتیکی ریز نمونه میوه نارس 64

فصل پنجم نتیجه گیری کلی و پیشنهادات… 69

1-5 نتیجه‌گیری کلی.. 70

2-5 پیشنهاد‌ها 72

فهرست منابع.. 74

فهرست جداول

جدول 1-3 ترکیبات تنظیم‌کننده‌های رشد در محیط کشت در آزمایشات اول، سوم، چهارم و هشتم.. 43

جدول 2-3 ترکیبات اکسین‌های مختلف در محیط کشت در آزمایشات دوم و نهم.. 44

جدول 1-4 تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی از ریز نمونه برگ رقم خضراوی 53

جدول 2-4 تأثیر غلظت ‌اکسین‌های مختلف بر جنین‌زایی سوماتیکی از ریز‌نمونه برگ رقم استعمران.. 56

جدول3-4 تجزيه واريانس تأثير کلشي‌سين و مدت زمان بر روي کالوس زایی در کشت بساک خرما ……….. 62

جدول 4-4 تجزیه واریانس تأثیر تیمار تنظیم‌کننده‌ی رشد بر کالوس‌زایی میوه نارس نخل خرما. 64

جدول 5-4 تجزیه واریانس تأثیر تیمار‌های تنظیم‌کننده‌ی رشد برکالوس‌زایی آندوسپرم نخل خرما 67

فهرست تصاویر

تصویر 1-2 گل آذین ماده و نر نخل خرما 10

تصویر 2-2 نمای شماتیک درخت و میوه‌ی نخل خرما 11

تصویر 1-3 تهیه برگ از پاجوش، برش برگ‌ها با طول 1-2 سانتی متر، کشت ریز‌نمونه در محیط کشت… 43

تصویر 2-3 برش برگ‌ها، قرار دادن برگ‌ها در آنتی اکسیدانت، برش ابتدایی و انتهایی برگ‌ها 45

تصویر 3-3 اسپات گل آذین نر، گل آذین باز شده از پوشینه، پوشانیدن اسپات گل نر در فویل آلومینیومی، خوشه‌های برش شده به قطعاتی حاوی چند گلچه، کشت بساک‌ها در محیط کشت، مرحله‌ی ‌نموی میکروسپور‌ها 46

تصویر 4-3 خوشه‌چه همراه با محور گل نر خرما، کشت بساک در محیط کشت مایع، قرار دادن پتری‌ها بر روی شیکر 47

تصویر 5-3 خوشه‌چه‌های نر خرما، بساک گل نر، قرار دادن بساک‌ها در محیط کشت… 48

تصویر 6-3 تصویر مش، رسوب میکروسپورها در محیط کشت ایزولاسیون، تصویر لام هموسایترمری.. 49

تصویر 7-3 گل آذین ماده، برش گل آذین به قطعاتی شامل 2-3 گلچه، کشت میوه‌های نارس در محیط کشت به 4 صورت مختلف. 50

تصویر 8-3 میوه نخل خرما، آندوسپرم جدا شده از پریکارپ، کشت آندوسپرم به همراه جنین و پریکارپ… 51

تصویر 1-4 تشکیل کالوس در لبه خارجی ریزنمونه‌ها، افزاش حجم کالوس در لبه خارجی ریزنمونه‌ها، تشکیل کالوس در کناره‌های رگبرگ مرکزی ریزنمونه‌ی برگی، کالوس‌زایی نسبتاً پایین در لبه‌های خارجی ریزنمونه‌ها 55

تصویر 2-4 رنگ سبز متمایل به زرد برگ‌های قرار گرفته در تاریکی، قهوه‌ای شدن برگ‌های قرار گرفته در نور، تشکیل کالوس در لبه خرجی برگ‌ها، قهوه‌ای شدن کاوس‌های تولید شده در برگ‌های قرار گرفته در معرض نور 58

تصویر 3- 4 نقاط سفید رنگ بر روی بساک، اندام‌زایی بر روی بساک، تولید کالوس در انتهای بساک‌ها 59

تصویر 4-4 ظهورنقاط سفید رنگ برروی بساک، ظهور رنگ سفید گچی در بساک‌های کشت شده در روز پنج‌ام، ظهور نقاط برجسته و متورم در بساک‌ها، تغییر رنگ‌ محیط‌های کشت در بساک‌های کاشته شده در روز‌های متفاوت، انتقال بساک‌ها به محیط کشت نیمه جامد. 60

تصویر 5 -4 کالوس تولید شده از بساک، جنین تولید شده از بساک. 63

تصویر 6-4: تشکیل کالوس سفید رنگ در ترکیب تیماری 2 (5 میلی‌گرم در لیتر 2,4-Dو TDZ)، سفید شدن میوه‌ها، تشکیل جنین در ترکیب تیماری 1 (5 میلی‌گرم در لیتر TDZ)، افزایش حجم کالوس در ترکیب تیماری 2 (5 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و TDZ). 66

تصویر 7–4 تشکیل کالوس، تشکیل ریشه‌چه در ترکیب تیماری 10 (5 میلی‌گرم 2,4-D و4 میلی‌گرم TDZ)، ج- تشکیل ساقه‌چه در ترکیب تیماری 17 (10 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D، 1 میلی‌گر‌م در لیتر BAP و 4 میلی‌گرم در لیتر TDZ) 68