مقاومت نسل دوم گیاه توتون تراریخت حاوی ژن لاکتوفرین به بیمارگرهای ویروسی و باکتریایی : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” مقاومت نسل دوم گیاه توتون تراریخت حاوی ژن لاکتوفرین به بیمارگرهای ویروسی و باکتریایی ” با گرایش زراعت و اصلاح نباتات و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده مقاومت نسل دوم گیاه توتون تراریخت حاوی ژن لاکتوفرین به بیمارگرهای ویروسی و باکتریایی:

بیماریها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین 31 تا 42% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آنها جلوگیری می کنند. کنترل بیماریها و سایر آفات گیاهی به طور فزاینده ای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. گروههای عمده بیمارگرها شامل ویروسها، باکتریها، قارچها، اوومیستها، ویروسها، نماتدها و حشرات میباشند. بیوتکنولوژی به طور موفقیتآمیزی در تولید محصولات گیاهی مقاوم علیه بیمارگرها و آفات موثر بوده است، در این روشها ژن بیان کنندهی پپتیدهای ضد میکروبی را در گیاهان بیان کرده و باعث مقاومت گیاه به بیماری مورد نظر شده است. پپتیدهای ضد میکروبی یکی از اجزای سیستم ذاتی ایمنی محسوب میشود که معمولا به عنوان اولین خط دفاعی علیه پاتوژنها عمل میکنند. چند ویژگی که معمولا در همهی پپتیدهای ضد میکروبی عمومیت دارد شامل: توالی کوتاه بین 30 تا60 اسید آمینواسید، خاصیت کاتیونی قوی، قابلیت تحمل دما تا 100 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه میباشد. پروتئین لاکتوفرین یکی از اعضای خانوادهی ترانسفرینها می باشد که دارای خاصیت اتصال شوندهگی به آهن است. در این پژوهش با مایه زنی ویروس موزاییک خیار به توتونهای تراریخت نسل دوم حاوی ژن لاکتوفرین، تاخیر در ظهور علایم نسبت به گیاهان تیپ وحشی دیده شد و با اندازهگیری میزان جذب نوری ویروس با استفاده از روش مستقیم الیزا در سه زمان 15، 20 و 35 روز بعد از مایه زنی ویروس موزاییک خیار اختلاف معنی داری در میزان جذب نوری ویروس نسبت به گیاهان تیپ وحشی نشان داد. بیان نسبی لاکتوفرین در گیاهان تراریخت یکنواختی بیان را در سه زمان نشان داد که نشان دهندهی کارکرد پایدار پروموتور 35s می باشد. سطح بیان ژن cp ویروس موزاییک خیار در گیاهان تیپ وحشی اختلاف معنی داری نسبت به گیاهان تراریخت نشان داد و سطح بیان نسبی ژن cp در گیاهان تراریخت نسبت به گیاهان تیپ وحشی کمتر بود که نشان دهندهی افزایش مقاومت در گیاهان تراریخت میباشد. مایه زنی باکتری Ralstonia solonacerum به گیاهان تراریخت و تیپ وحشی باعث ظهور علایم فوق حساسیت شد.

مقدمه

براساس یک تخمین محافظه کارانه، بیماریها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین 31 تا 42% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آنها جلوگیری میکنند. میزان خسارت به طور معمول در کشورهای پیشرفته و در کشورهای در حال پیشرفت که نیاز غذایی بیشتری دارند، بالاتر است (Tisdell and Xiang, 1998). اگر متوسط میزان خسارت را 5/36% بگیریم، سهم بیماری ها، حشرات و علف های هرز دراین خسارت به ترتیب 1/14%، 2/10% و 2/12% شده است. با توجه به اینکه بیماری ها به تنهایی موجب نابودی 1/14% محصولات می شوند، مقدار خسارت سالانه آنها در سطح جهانی بالغ بر220 میلیارد دلار می شود (Wood and Derek, 2001).
طی یک صد سال گذشته، کنترل بیماریها و سایر آفات گیاهی به طور فزایندهای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. کنترل بیماریهای گیاهی اغلب کاربرد این مواد سمی را نه تنها بر روی گیاه و محصولات گیاهی مورد استفادهی ما، بلکه درون خاک جایی که بسیاری از میکروارگانیزمهای بیماریزا زندگی کرده و به ریشهی گیاه حمله میکنند، ضروری ساخته است. بسیاری از این مواد شیمیایی برای میکروارگانیزمهای غیر هدف، حیوانات و حتی برای انسان نیز ممکن است سمی باشند. دشوار است که بتوان هزینههای بلند مدت و کوتاه مدت آلودگی محیط زیست بر سلامتی و بهزیستی انسان را که براثر تلاش ما برای کنترل بیماری های گیاهی و سایر آفات به وجود می آید، تخمین زد. شمار زیادی از بیمارگرهای گیاهی از ویروئیدهای دارای چند صد نوکلئوتیدی تا گیاهان عالی در محصولات کشاورزی ایجاد بیماری میکنند. دامنهی اثرات این بیماری زا از اثرات خفیف تا نابودی کامل محصول است. گروههای عمده بیمارگرها شامل ویروسها، باکتریها، قارچها، اوومیستها، ویروسها و نماتدها میباشند. کنترل عوامل بیماریزای گیاهی مشکل است زیرا جمعیت آنها بسته به زمان، مکان و نوع ژنوتیپ متغیر است. بنابراین برای مبارزه با تلفاتی که آنها به وجود می آورند، لازم است به تعریف مشکل پرداخت و به دنبال راهحلهایی بود. در سطح زیستی نیاز به روشهایی برای تشخیص دقیق و سریع اورگانیزم ایجاد کنندهی، بیماری تخمین دقیق شدت بیماری، اثر بیماری روی محصول و تشخیص مکانیسم های بیماریزایی میباشد. در مرحلهی بعد خسارت بیماری باید به وسیلهی کاهش مایه تلقیح بیمارگر، کاهش مکانیسم های بیماریزایی آن و افزایش گوناگونی ژنتیکی در محصول به حداقل برسد (Reed et al., 2003). هدف بیشتر پژوهشهای جدید در بیماریشناسی گیاهی یافتن شیوههای دیگر برای کنترل بیماریهای گیاهی است که به محیط زیست آسیب کمتری برسانند. روشهای انتقال در سالهای اخیر به عنوان یک موضوع مهم برای ایجاد مقاومت مورد بررسی قرار گرفته است. امید بخشترین این روشها عبارتند از:
تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق مهندسی ژنتیک
تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق بهنژادی گیاهی سنتی
کاربرد فنون زراعی برای سرکوب بیماری
کاربرد فنون خاموشی ژن
استفاده از مواد غیر سمی افزایش دهندهی مقاومت
بهرهوری از عوامل زیستی ناهمساز به میکرواورگانیزمهای مولد بیماری (ایزدپناه و همکاران، 1389 و Strange et al., 2005)
با توجه به ضرورت ارقام گیاهی مقاوم به تنشهای زیستی و غیر زیستی و نارسایی روشهای سنتی بهنژادی گیاهی، به کارگیری روشهای موثر تنها راه برون رفت از این مشکل میباشد. در سالهای اخیر، با پیشرفت بدست آمده از در زیست شناسی مولکولی و روشهای کشت بافتی گیاهی روشهای جدیدتر و کارآمدتری را در مهندسی ژنتیک، برای چیرهگی بر محدودیتهای بهنژادی گیاهی سنتی فراهم کرده است. بنابراین استفاده از مهندسی ژنتیک برای دستیابی به ارقام مفید می باشد. با استفاده از فنون انتقال ژن، گیاهان تراریخت با یک ویژگی مشخص می توانند یک ژن از منبع ژنی متفاوت دریافت نمایند به نحوی که سایر ویژگیهای مطلوب گیاه تحت تاثیر قرار نگیرد. بنابراین کاربرد سموم شیمیایی هنوز موثرترین روش برای کنترل بیماریهای گیاهی هستند، اما کاربرد بیش از اندازهی باکتریکش‌ها و قارچکشهای شیمیایی منجر به شدید شدن و طولانی شدن دورههای آلودگی محیط زیست و مقاوم شدن بیمارگرها نسبت به این سموم شده است (Daoubi et al., 2005). اگرچه روشهای اصلاحی یکی از موثرترین راهکارها در تولید گیاهان مقاوم به بیماریها بوده اما این روش دارای محدودیتهایی مانند فقدان پل ژنی دهندهی مناسب و شکستن مقاومت میباشد. از سوی دیگر روشهای بیوتکنولوژی به طور موفقیتآمیزی در تولید محصولات گیاهی مقاوم علیه بیمارگرها و آفات موثر بوده است، در این روشها ژن بیان کنندهی پپتیدهای ضدمیکروبی را در گیاهان بیان کرده و باعث مقاومت گیاه به بیماری مورد نظر شده است (Tingquan et al., 2013).

هدف

در این پروژه بیمارگرهای باکتریایی و ویروسی به گیاهان ترایخت نسل دوم توتون حاوی ژن لاکتوفرین شتر عربی با هدف ایجاد مقاومت توتونهای تراریخت نسبت به این بیمارگرها مایهزنی گردید.

فهرست جدول‌ها

جدول 3-1- محول ضدعفونی کننده بذر توتون 16
جدول 3-2- تهیه ی بافر استخراج DNA 19
جدول 3-3- پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر و تایید ژن لاکتوفرین 20
جدول 3-4- سیکل گرمایی استفاده شده در هر واکنشPCR 21
جدول 3-5- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR 22
جدول 3-6- نوع و میزان مواد به کار رفته برای تیمار DNase 25
جدول 3-7- مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA 26
جدول 3-8- مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA 27
جدول 3-9- آغازگرهای به کار رفته ژن لاکتوفرین برای Real-Time PCR و ژن کنترل داخلی 27
جدول 3-10- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی…… 28
جدول 3-11- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن کنترل داخلی 29
جدول 3-12- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژنcp ویروس موزاییک خیار و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی 30
جدول 3-13- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار و ژن کنترل داخلی 30
جدول 4-1- تاخیر ظهور علایم پس از 15 روز از مایه زنی ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت 36

فهرست شکل ها

شکل 4-1- ظهور علایم در توتون های تیپ وحشی 33
شکل 4-2- گیاهان تراریخت هنگام ظهور علایم در تیپ وحشی‌ها 34
شکل 4-3- گیاهان تیپ وحشی بعد از 30 روز مایه زنی ویروس موزاییک خیار 34
شکل 4-4- گیاهان تراریخت پس از 15 روز از ظهور علایم در تیپ وحشیها 35
شکل 4-5- آزمون الایزا در زمان صفر 37
شکل 4-6- رشد ویروس در تراریخت ها و تیپ وحشی در 20 روز بعد ازمایه زنی ویروس موزاییک خیار 38
شکل 4-7- آزمون الایزا در زمان 30 روز بعد مایه زنی ویروس موزاییک خیار 39
شکل 4-8- نقوش الکتوفروزی محصول PCR با پرایمرهای partial ژن لاکتوفرین 40
شکل 4-9- استخراج RNA از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی 40
شکل 4-10- نقوش الکتروفورز PCR آغازگرهای Real-Time با آغازگرهای ژن لاکتوفرین: 41
شکل 4-11- تیمار DNase توتون تیپ وحشی پس از 22 روز از مایه زنی باکتری 41
شکل 4-12- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن لاکتوفرین در لاینهای تراریخت 42
شکل 4-13- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار 43
شکل 4-14- کشت عصاره ی حاصل از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی 44
شکل 4-15- پژمرده گی گوجه پس از 26 روز از مایه زنی باکتری 45
شکل 4-16- توتون تراریخت 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum 45
شکل 4-17- توتون تیپ وحشی 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum 45

راهنمای خرید و دانلود فایل

برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.

بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.

در صورت بروز  هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما  پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.

برای دانلود فایل روی دکمه خرید و دانلود  کلیک نمایید.