اثر چندشکلی های ژن GHبر صفات رشد در ماهی سفید دریای خزر (Rutilus kutum) و کپور معمولی (Cyprinus carpio) به روش PCR-SSCP : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی شیلات

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان”  اثر چندشکلی های ژن GH بر صفات رشد در ماهی سفید دریای خزر (Rutilus kutum) و کپور معمولی (Cyprinus carpio) به روش PCR-SSCP ” با گرایش  کشاورزی شیلات و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده اثر چندشکلی های ژن GH بر صفات رشد در ماهی سفید دریای خزر (Rutilus kutum) و کپور معمولی (Cyprinus carpio) به روش PCR-SSCP:

هورمون رشد (GH) مهم‌ترین هورمون کنترل کننده رشد سلول‌های سوماتیک و موثر در سنتز پروتئین، چربی و کربوهیدرات‌هامی‌باشد. هدف از پژوهش حاضر شناسایی چند شکلی‌های ژن GH-1‌در ماهی کپور معمولی و GH-2 در ماهی سفید با استفاده از تکنیک PCR-SSCP و ارتباط آن با صفات مرتبط به رشد (فاکتور وضعیت، طول و وزن بدن) بوده است. تعداد 150 قطعه ماهی کپور در 4 گروه سنی 4، 6، 12و 24 ماهه و 150 قطعه ماهی سفید در سن 3 ماهگی به طور تصادفی انتخاب  و از باله دمی برای استخراج DNA استفاده شد. پس از استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته، دو قطعه به اندازه 373 و 410 جفت باز به ترتیببرایجایگاه‌هایژنی GH-1در ماهی کپور معمولی و GH-2 در ماهی سفید تکثیر و تعیین ژنوتیپ افراد به روش SSCPانجام گرفت. در نمونه‌های مورد مطالعه 8الگویباندی متفاوتA،B، C، D، E، F، G و Hدر جمعیتکپورماهیانبهترتیببافراوانی‌های 33/31، 67/10، 67/20، 67/22، 4، 2، 67/2 و 6 درصد و 3 الگوی باندی متفاوتA، B و C به ترتیب با فراوانی 67/24، 67/58 و 67/16 درصد در جمعیت ماهی سفیدمشاهده شد. تجزیه و تحلیل نشانگر- صفت ارتباط معنی دار آماری بین ژنوتیپ های مختلف ژن GH-2 ماهی سفید با صفات وزن، طول بدن و فاکتور وضعیت وجود ندارد.همچنین بین ژن GH-1 ماهی کپور در سه گروه سنی 4 ماه، 6 ماه و 12 ماه با صفت وزن ارتباط معنی دار آماری (05/0>P) وجود دارد در حالی که با صفات طول و فاکتور وضعیت ارتباط معنی داری مشاهده نشد. آزمون چند دامنه‌ای دانکن برای جمعیت ماهیان کپور معمولی در سه گروه سنی 4 ماه، 6 ماه و 12 ماه نشان داد که ماهیان با ژنوتیپ دارای الگوی باندی D به طور معنی داری (05/0>P) دارای وزن بیشتری نسبت به سایر ژنوتیپ ها بودند. همچنین آزمون چند دامنه‌ای دانکن برای ماهی سفید نشان داد که افراد با ژنوتیپ C،CFبالاتری (05/0>P)  نسبت به افراد با ژنوتیپ A داشتند. از نظر صفات وزن و طولدر داخل جمعیت ماهیان سفید، هیچ کدام از ژنوتیپ ها با یکدیگر اختلاف معنی دار نداشتند. نتایج تعیین توالی قطعه تکثیری در ماهی سفید نشان داد که در الگوی باندیC، نه SNP به صورت تغییرنوکلوتیدیT به G در موقعیت 82 جفت بازی، A به C در موقعیت 113 جفت بازی، G به A در موقعیت 207 جفت بازی، G به A در موقعیت 254 جفت بازی، G به A در موقعیت 269 جفت بازی، G به A در موقعیت 296 جفت بازی، A به G در موقعیت 307 جفت بازی، C به A در موقعیت 308 جفت بازی و G به A در موقعیت 346 جفت بازی رخ داده است. همچنین در موقعیت 366 جفت بازی در الگوی باندی B یک جهش از نوع حذف مشاهده شد. مشاهده هشت الگوی باندی مختلف در جایگاه مورد مطالعه در این پژوهش نشان دهنده تنوع زیاد در جایگاهژنیGH-1 در جمعیت ماهیان کپور معمولی می‌باشد. بنابراین با توجه به اهمیت اقتصادی ماهی کپور معمولی و ماهی سفید در صنعت پرورش و  وجود همبستگی بین چندشکلی‌های مشاهده شده و صفات رشداحتمالا بتوان از اینجایگاهنشانگری در برنامه‌های اصلاح ن‌ژادی در جمعیت‌های مورد مطالعه بهره برد. به هر حال جهت دست یابی به نتایج مطمئن نیاز به تکرار آزمون با تعداد نشانگر بیشتر از اینجایگاه‌هایژنی و اندازه نمونه‌هایبزرگ‌تر از اینجمعیت‌هامی‌باشد.

مقدمه

روند رو به رشد جمعیت جهان و متعاقب آن افزایش نیازهای پروتئینی باعث شده است که بشر به مصرف آبزیان ازجمله ماهیان رو آورد. همچنین کاهش ذخایر آبزیان بشر را بر آن داشته تا برای پرورش گسترده آبزیان در محیط‌های آبی کوچک و محدود نیز اقدام کند. امروزه تقاضا برای مصرف ماهی در کلیه نقاط دنیا در حال افزایش است. به همین دلیل پیشرفت سریع در برنامه‌های تحقیقاتی به خصوص در زمینه تکثیر، پرورش، تغذیه، ژنتیک و مدیریت سیستم‌های پرورشی مورد نیاز خواهد بود. تقاضای جهانی برای مصرف ماهی و فرآورده‌های دریایی تحت تاثیر سه عامل افزایش جمعیت، میزان درآمد و قیمت آن است. پیش بینی شده است که تا چند سال آینده تقاضای جهانی برای مصرف ماهی و فرآورده‌های دریایی به بیش از 100 میلیون تن برسد (فائو، 2008). برای بهره برداری بیشتر از سیستم‌های تولید باید به دنبال راهکارهایی از قبیل اصلاح نژاد، بهبود تغذیه و یا مدیریت صحیح پرورش باشیم. در این بین اصلاح نژاد که به منظور تغییر ظرفیت ژنتیکی برای صفات اقتصادی مورد نظر انجام می‌گیرد، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. صفات مختلف یک حیوان را می‌توان از نظر تعداد ژن‌های کنترل کننده و میزان تاثیر عوامل محیطی به دو دسته صفات کمی و کیفی تقسیم بندی کرد. صفات کیفی توسط یک یا تعداد کمی ژن بیان می‌شوندو عوامل محیطی در بروز این صفات اهمیت چندانی ندارند، ولی صفات کمی اغلب توسط تعداد زیادی ژن کنترل می‌شوند و در بروز آن‌ها عوامل محیطی موثر هستند. اغلب صفات کیفی وراثت پذیری بالایی دارند، در نتیجه انتخاب و اصلاح این صفات نسبتا آسان است و غالبا نیازی به انتخاب غیر مستقیم وجود ندارد. ولی صفات کمی که عوامل محیطی بر آن‌ها موثر است، فنوتیپ موجود ممکن است گویای ژنوتیپ صفات نباشد. برای رفع این مشکل تکنیک‌های پیشرفته اصلاح نژاد با استفاده از علم آمار تدوین شده است. این روش‌ها در چندین سال اخیر مفید بوده و پیشرفت‌های قابل توجه ای را موجب شده است (هرندی،1377). امروزه تکنیک ژنتیک مولکولی انقلابی در تجزیه ژنتیکی گونه‌های اهلی ایجاد کرده است. به طوری که بر اساس آن می‌توان چند شکلی را در سطح DNA[1]شناسایی و از آن به عنوان نشانگرهای مولکولی استفاده کرد و به مطالعه افراد و موجودات مختلف پرداخت (ولر و همکاران،1990).

ماهی سفید[2]دریای خزر در بین ماهیان استخوانی یکی از گونه‌های با ارزش و اقتصادی در حوزه جنوبی این دریا می‌باشد که با توجه به لذیذ بودن، ارزش غذایی بالا و کیفیت عالی گوشت بیش از 50% کل صید این ماهیان را به خود اختصاصمی‌دهد، به طوری که میزان صید آن در سال 1386 بالغ بر 17 هزار تن بود (قاسمی و همکاران 1386). در سه استان همجوار دریای خزر میزان صید ماهی سفید 63/59% از کل صید ماهیان این دریا را در سال 1390 به خود اختصاص داده است (معاونت صید استان‌های گلستان، مازندران، گیلان). دو نژاد بهاره و پاییزه ماهی سفید در دریای خزر وجود دارند که نژاد بهاره آن بیش از 98% ذخایر ماهی سفید دریای خزر را تشکیل می‌دهد. در سال‌های اخیر، ذخایر نژاد پاییزه ماهی سفید به علت از بین رفتن بسترهای طبیعی تخم ریزی، صید بی رویه و دیگر عوامل تاثیر گذار کاهشیافته است(قاسمی و همکاران 1386).

ماهی کپور معمولی[3]از خانواده کپور ماهیان[4]، بومی آسیای مرکزی است که طی قرن‌های متمادی در نواحی مختلف جهان گسترش پیدا کرده است. دریای خزر زیستگاه مهمی برای کپور معمولی وحشی است که یکی از ماهیان اقتصادی و منبع غذایی مهمی محسوب می‌شود لذا سهم بزرگی در تقویت منبع این ماهی در دریا دارد (یوسفیان، 2011). هر چند این گونه به صورت بومی و طبیعی در تمام سواحل دریای خزر وجود دارد و برای تولیدمثل وارد مصب رودخانه‌هامی‌شود، اما در سال‌های اخیر به دلیل صید بیش از حد و از بین رفتن محل‌های تولید مثل، نسل آن‌ها کاهش پیدا کرده است به طوری که جزو گونه‌های نیازمند به حفاظت در منطقه به شمار می‌رود (قلیچ پور و همکاران 1389).

در حال حاضر، کاهش ذخایر آبزیان در اکثر نقاط دنیا توجه متخصصین را به اعمال روش‌های دقیق ازجمله روش‌های مولکولی جهت مدیریت ذخایر آبزیان جلب نموده است و شناسایی گونه‌ها و اصلاح نژاد آن‌ها در برنامه‌های بهره برداری از ذخایر آبزیان دریایی و آبزی پروری از اهمیت زیادی برخوردار است. علی رغم اهمیت این گونه‌یبا ارزش که در بین ساکنین حوضه جنوبی دریای خزر از اهمیت اقتصادی بالایی برخوردار است، مطالعات اندکی در زمینه ساختار ژنتیکی و جمعیت شناختی آن صورت گرفته است(قاسمی و همکاران 1386).

هورمون رشد[5] (GH) نقش ضروری در تنظیم رشد، تقسیم سلولی، تمایز سلولی و بزرگ شدن اندازه سلول‌ها بازی می‌کند. اهمیتGH به عنوان یک عامل موثر در افزایش رشد از مدت‌ها پیش مشخص شده است.نشان داده شد که به کارگیری GH باعث افزایش میزان رشد در بیشتر حیوانات به خصوص ماهی می‌شود (سانسانسن و همکاران، 2009 و ژانگ و همکاران، 2014).همچنین نشان داده شد که GH رشد را به طور مستقیم از طریق افزایش سنتزDNA، پروتئین و لیپولیز در ماهیچه تحریک می‌کند. هورمون رشد از طریق تاثیر بر تولید و رها سازی یک میتوژن به نام I-IGF[6] که هم توسط کبد و هم بیشتر بافت‌های پیرامونی تولید می‌شود، به طور غیر مستقیم فرایند رشد را کنترل می‌کند(کلنگی میاندر و همکاران، 2013).

جهش‌های موجود در نواحی مختلف ژن‌ها همواره مورد توجه بسیاری از متخصصان علم اصلاح نژاد می‌باشد. ارتباط چند شکلی این ژن‌ها با خصوصیات فنوتیپی به عنوان مثال رشد به طور وسیعی در دیگر حیوانات مورد بررسی قرار گرفته و مطالعات محدودی نیز در مورد ماهی انجام شده است (گروس و نیلسون، 1999 و تائو و بولدینگ، 2003). آنالیز قطعاتی از ساختار ژن هورمون رشد و گیرنده هورمون رشد[7](GHR) در سطح سلول (چه کروموزوم و یاcDNA) اهمیت بنیادی و کاربردی دارد. ژن هورمون رشد و گیرنده آن راکه از DNAهسته‌ای به دست آمده‌اندمی‌توان برای مطالعه تکامل و ارتباط بینگونه‌ای و داخل گونه‌ای استفاده نمود. شناسایی تنوع آللهای ژن هورمون رشد در داخل گونه می‌تواند به انتخاب صفات رشد مطلوب در ماهی کمک شایانی نماید (کوخر و کهلمن، 2011).

[8]SSCP روشی بر اساس رابطه بین تحرک الکتروفورزی تک رشته DNA و فرایند تاخوردن آن است که به نوبه خود، نشان دهنده توالی نوکلئوتیدها است. این روش، سریع و انجام آن آسان است. علاوه بر این، از آن‌جا که حتی تغییرات تک بازی در یک توالی به احتمال زیاد به رونوشت‌های مختلف می‌انجامد، گونه‌های بسیار نزدیک را حتی با استفاده از قطعات بسیار کوتاه می‌توانبا دقت از هم جدا کرد (تلچا، 2009). نرخ شناسایی جهش‌هاینقطه‌ایSSCP در سیستم‌های مختلف 90-80% است که برای شناسایی جهش‌ها روشی کارامد، مناسب و اقتصادی است (اکسین و جینگو، 2011). این روش تا به حال بر روی اینماهی‌ها انجام نشده است. به علاوه هنوز اساس مکانیزم ژنتیکی صفات مختلف در این گونه مشخص نشده است(اکسو و همکاران، 2012).

ژن‌های کاندیدا و اهمیت آن‌ها

راهکار ژن‌های کاندید یکی از روش‌های بسیار قوی در بررسی ارتباط چندشکلی ژن با صفات اقتصادی مهم در آبزی‌پروری است (تیان و همکاران، 2014). از آن‌جایی‌که در بروز صفات و خصوصیات اقتصادی عوامل محیطی نیز موثرند لذا شناسایی ژن‌های مرتبط با آن‌ها، برای ایجاد تغییرات مهم اقتصادی و تسریع اصلاح صفات و انتخاب مستقیم موجودات برای این گونه صفات ضروری است. امروزه روش‌های ژنتیک مولکولی به کشف ژن‌های بزرگ اثر که روی برخی صفات کمی مهم موثر هستند، کمک زیادی کرده است (QTL[1] و مارکرهای ژنتیکی که با QTL پیوستگی دارند). با توجه به شناخت، از نقش و عملکرد این ژن‌ها، انتخاب بر اساس داده‌های مولکولی بر این فرض استوار است که همه افرادی که برای ژن‌های بزرگ اثر تعیین ژنوتیپ شده‌اند، قبل از سن انتخاب قرار دارند. چنانچه هدف فقط انتخاب بر اساس ژن بزرگ اثر باشد در صورتی که مشخص شود یک آلل نسبت به آلل دیگر ارجعیت دارد و افرادی که ترجیحا دو آلل و یا یک آلل ارجع را دارند انتخاب شوند با حداکثر سرعت ممکن منجر به ثبوت آلل های فوق در جامعه خواهد شد. البته این سرعت وابسته به فراوانی ژن‌ها و فشار حاصل از انتخاب خواهد بود. در حالت انتخاب بر اساس ژنوتیپ، فراوانی ژن مورد نظر با سرعت بالایی افزایش می‌یابد و در نهایت ثابت باقی می‌ماند (موری، 2000). در ماهی تعدادی از ژن‌های موثر بر رشد شامل PIT1[2]، IGF، GHRH[3]، GHR و GHشناسایی شده‌اند.هدف از این پژوهش بررسی ارتباط چند شکلی‌های ژن هورمون رشد (GH) با صفات رشد در دو گونه کپور معمولی و ماهی سفید دریای خزر بوده است.

بحث و نتیجه گیری

چندشکلی ژن GH-1 کپور معمولی دریای خزر هشت نوع ژنوتیپ و چندشکلی ژن GH-2 ماهی سفید سه نوع ژنوتیپ را نشان داد. بین ژن GH-1کپور معمولی و وزن بدن در سه گروه سنی 4، 6 و 12 ماهه از لحاظ آماری ارتباط معنی داری مشاهده شد. همچنین ارتباط معنی دار آماری بین ژن GH-2 ماهی سفید و صفات وزن، طول و فاکتور وضعیت از لحاظ آماری ارتباط معنی داری مشاهده نشد. نتایج نشان می‌دهد که محصولات بیان ژن‌هایGH-1و GH-2 قادر به تحریک رشد در کپور معمولی و ماهی سفید است، اما عملکرد اجرایی این ژن‌ها تا حدودی تحت تاثیر ژنوتیپ‌های مختلف شناسایی شده، متفاوت است. در ماهی سفید ژنوتیپ B و سپس A دارای بیشترین فراوانی بودند. همچنین در کپور معمولی ژنوتیپ D بیشترین فراوانی را داشت و پس از آن ژنوتیپ های C و B فراوانی بیشتری نسبت به سایر ژنوتیپ ها دارند. نتایج پژوهش‌های مو و همکاران (2004)در هفت جمعیت کپور وحشی، هفت نوع الگو (A، B، C، D، E، F و G) در ناحیه اینترون 2 ژن GH-1 به روش PCR-SSCP شناسایی کردند که طول آن‌ها به ترتیب 189، 196، 204، 205، 206، 207 و bp 209 بود.در پژوهش حاضر نیز هشت الگوی باندی متفاوت در ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و قسمتی از اگزون 5 ژن GH-1 کپور معمولی مشاهده شد که نشان دهنده تنوع بالای این ژن در این جمعیت است.

نتایج پژوهش‌های نی و همکاران(2012) در یک جمعیت از ماهی کراکر زرد، به روش PCR-SSCP دو هاپلوتیپ از اینترون 1 را بهنام ژنوتیپ های AA و AB نشان داد. درAB، یک چندشکلی تک نوکلئوتیدی(SNP) در موقعیت 196 (G→A) مشاهده شد که با وزن بدن همبستگی منفی داشت.که با نتایج حاصل از پژوهش حاضر در سه گروه سنی 4، 6 و 12 ماه ماهی کپور معمولی مغایرت دارد زیرا در ماهی کپور معمولی الگوی باندی Dنسبت به سایر الگوهای باندی مشاهده شده وزن بیشتری داشتند.

گزارش شده است که بیشترین چندشکلی‌های شناسایی شده در GHماهی‌هادر اینترون ها رخ داده‌اند (فربس و همکاران، 1994؛ پارک و همکاران، 1995؛ گروس و همکاران، 1996؛ آلمولی و همکاران، 2000 و مو و همکاران، 2004). احتمالا چندشکلی‌های مشاهده شده در پژوهش حاضر نیز بیشتر در ناحیه اینترونی بوده است. با وجودی که اینترون‌ها مناطق غیرکدشونده ژن هستند اما به طور موثری می‌توانند در رونویسی، ترجمه، بیان ژن و دیگر فرایندهای موثر بر مراحل رشد و نمو ماهی مشارکت داشته باشد (نی و همکاران، 2012). همچنین بیان شده است که ژن هورمون رشد به صفات مربوط به رشد از طریق چندشکلی در سطح DNA کمک می‌کند و ممکن است این وظیفه خود تنظیمی ژن هورمون رشد باشد (کنگ و همکاران، 2002). در پژوهش حاضر پس از مشاهده سه نوع ژنوتیپ در ماهی سفید جهت اطمینان از تکثیر قطعه مورد نظر و به دست آوردن توالی جایگاه GH-2در ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و اگزون 5 این ماهی برای اولین بار، سه الگوی باندی مشاهده شده توالی یابی شد. نتایج تعیین توالی نشان داد که نهSNP در الگوی باندی C و یک حذف تک نوکلئوتیدی در الگوی باندی Bدر مقایسه با توالی الگوی باندی Aرخ داده است.نتایج حاصل از بلاست توالی‌های به دست آمده از ماهی سفید با دیگر ماهیان خانواده کپور، بیشترین هم‌پوشانی را با مروارید ماهی[1](95٪)و سپس با بیگ‌هد[2]، کپور نقره‌ای و آمور (94٪) نشان داد.اما درصد هم‌پوشانیتوالی‌های به دست آمده از ماهی سفید با ماهی کپور معمولی کمتر است (85٪). که نتایج حاصل از هم‌ترازی توالی این دو گونه نیز آن را تایید می‌کند و این نشان دهنده این است که تفاوت‌های بین این دو گونه در این جایگاه زیاد است. شاید به همین علت باشد که نرخ رشد در ماهی سفید نسبت به ماهی کپور معمولی کمتر است.

در پژوهش حاضر در جایگاه GH-2 ماهی سفید علت اینکه سه ژنوتیپ در جمعیت رخ داده است دو دلیل می‌تواند داشته باشد. ممکن است به دلیل اندازه محدود نمونه‌ها باشد و یا اینکه احتمالا در جمعیت مورد بررسی انتخاب آلل B رخ داده است زیرا در سه ژنوتیپ آلل B وجود دارد.

تیان و همکاران (2014) ارتباط چندشکلی ژن GH با صفات رشد در 282 نمونهماهی سوف چینیرا مورد بررسی قرار دادند. آن‌هابا استفاده از توالی یابی چهار SNP در ژن GH شناسایی کردند که دو جهش در اینترون 4، یک جهش در اگزون 5 و یک جهش در اینترون 5 رخ داده بود که سه جهش از آن‌ها ارتباط مثبت معنی داری در اجرای فرایند رشد نشان داد. نتایج پژوهشآن‌هانشان داد که SNP های ژن GHمی‌تواند بر اجرای رشد موثر باشد و می‌توان از این نشانگر در انتخاب مبتنی بر نشانگر (MAS[3]) این گونه استفاده کرد. که با نتایج این پژوهش در هر دو گونه مورد بررسی مطابقت دارد.

احتمالا علت اینکه در جمعیت مورد مطالعه کپور معمولی و ماهی سفید، این ناحیه از ژن‌هایGH-1 و GH-2از لحاظ آماری با صفات مربوط به رشد معنی دار نشد؛ این است که صفات رشد علاوه بر ژن GH متاثر از ژن‌هایدیگری همچون گیرنده هورمون رشد (GHR)، فاکتور شبه انسولین I وII (IGF I,II)، هورمون آزاد کننده هورمون رشد (GHRH)، هورمون مهارکننده هورمون رشد (GHIH) و سوماتواستاتین (SRFI14) است (مورکاوا،2008). همچنین علت عدم مشاهده ارتباط معنی دار آماری بین ژنوتیپ های مختلف ژن GH در پژوهش حاضر می‌تواند تعداد کم نمونه‌های مورد بررسی نیز باشد. از سوی دیگر 98/0 ارتباط ژنتیکی بین وزن و طول در کپور معمولی در گروه سنی هشت هفته‌ای با استفاده از هشت نشانگر ریزماهواره مشاهده شد (واندپوت و همکاران، 2004).

با توجه به نتایج حاصل از این پژوهش می‌تواننتیجه‌گیری نمود که تکنیک SSCPروشی مناسب برایشناساییچندشکلیدر نمونه‌های ماهی کپور و ماهی سفید خواهد بود. همچنین با توجه به اهمیت اقتصادی ماهی کپور معمولی و ماهی سفید در صورت اثبات رابطه بین چندشکلی‌های مشاهده شده در این پژوهش و صفات رشد می‌توان به کمک نشانگرهای مورد نظر مولدین مناسب برای این گونه‌ها یا حتی گونه‌های دیگر را انتخاب کردMAS) ).با توجه به یافته‌هایاین مطالعه و اندازه محدود نمونه‌ها، بر بیشتر بودن نمونه‌ها تاکید می‌گردد.

فهرست مطالب

فصل اول 1
مقدمه و کلیات 1
1-1 مقدمه 2
1-2 ژن‌های کاندیدا و اهمیت آن‌ها 4
فصل دوم 5
بررسی منابع 5
2-1 مروری کوتاه بر خصوصیات بیولوژیکی و زیستگاهی ماهیان مورد مطالعه 6
2-1 کپور شکلان 6
2-1-1 خانواده کپور ماهیان 6
2-1-1-1 ماهی سفید 7
2-1-1-2 کپور معمولی 8
2-2 زیستگاه 9
2-3 تغذیه 10
2-4 سن بلوغ 10
2-5 رشد و عوامل موثر بر آن 10
2-5-1 تنظیم رشد 11
2-5-2 هورمون رشد 11
2-5-3 کنترل ترشح هورمون رشد 12
2-5-4 اثرات متابولیکی هورمون رشد 12
2-5-4-1 افزایش سرعت پروتئین سازی در بیشتر سلول‌های بدن 12
2-5-4-2 افزایش رونویسی هسته‌ای DNA برای ساخت RNA 13
2-5-4-3 افزایش میزان چربی‌ها برای تولید انرژی 13
2-5-4-4 کاهش مصرف کربوهیدرات‌ها 13
2-6 ژن هورمون رشد 13
2-7 نشانگرهای ژنتیکی 14
2-7-1 نشانگرهای ریخت شناسی 15
2-7-2 نشانگرهای فیزیولوژیکی 15
2-7-3 نشانگرهای سیتوژنتیکی 15
2-7-4 نشانگرهای پروتئینی 15
2-7-5 نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولی 16
2-8 نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 16
2-9 واکنش رنجیره ای پلیمراز (PCR) 17
2-9-1 بافر RCR 18
2-9-2 کلرید منیزیم (Mgcl2) 18
2-9-3 دی اکسی نوکلئوتیدها (dNTPs) 18
2-9-4 آنزیم تک پلیمراز 19
2-9-5 آغازگرها 19
2-10 چند شکلی فضایی رشته‌های منفردSSCP) ) 19
2-11 مروری بر برخی پژوهش‌های انجام شده: 20
فصل سوم 22
مواد و روش‌ها 22
3-1 نمونه برداری 23
3-2 بررسی فاکتور وضعیت 23
3-3 استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته 23
3-3-1 طرز تهیه بافرهای استخراج DNA 23
3-4 تعیین ویژگی‌های کمی و کیفی DNA استخراج شده: 24
3-4-1 ژل آگارز 24
3-4-2 رنگ آمیزی ژل آگارز 25
3-5 تعیین غلظت DNA استخراج شده با استفاده از اسپکتوفتومتر 26
3-6 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) 26
3-6-1 پروتکل و مواد استفاده شده در PCR 26
3-6-2 مراحل PCR 27
3-6-3 تنظیم سیکل‌های حرارتی PCR 28
3-6-3-1 واسرشته سازی قطعه الگو 28
3-6-3-2 اتصال آغازگرها: 28
3-6-3-3 بسط (طویل سازی) آغازگرها: 28
3-7 چندشکلی فضایی در تک رشته DNA (SSCP) 29
3-8 الکتروفورز محصولات SSCP روی ژل اکریل آمید 30
3-8-1 تهیه ژل پلی اکریل آمید 30
3-8-2 آماده سازی دستگاه الکتروفورز عمودی 31
3-8-3 رنگ آمیزی با نیترات نقره 32
3-8-3-1 مراحل انجام رنگ آمیزی نیترات نقره: 32
3-9 مراحل انجام کار 33
3-10 تعیین توالی الگوهای باندی مشاهده شده در جمعیت مورد مطالعه 34
3-11 تجزیه تحلیل داده‌ها 34
3-11-1 تجزیه و تحلیل آماری ژنتیک جمعیت و ارتباط نشانگر- صفت 34
3-11-2 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک توالی‌های به دست آمده 35
فصل چهارم 36
نتایج 36
4-1 بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 37
4-2 تکثیر قطعات مورد نظر 37
4-2-1 ژن GH-2 ماهی سفید 37
4-2-2 ژن GH-1 ماهی کپور معمولی 38
4-3 الگوهای باندی مشاهده شده جایگاه GH 38
4-3-1 ژن GH-2 ماهی سفید 38
4-3-1-1 بررسی فاکتور وضعیت ماهی سفید 39
4-3-1-2 بررسی ارتباط بین نشانگر- صفت در جایگاه GH-2 ماهی سفید 39
4-3-2 ژن GH-1 ماهی کپور معمولی 40
4-3-2-1 بررسی فاکتور وضعیت کپور معمولی 41
4-3-2-2 بررسی ارتباط بین نشانگر- صفت در جایگاه GH-1 ماهی کپور معمولی 41
4-5 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک 42
4-5-1 توالی یابی 42
4-5-2 مقایسه توالی GH-2 ماهی سفید و ماهی کپور معمولی 43
4-6 تعیین ژنوتیپ الگوهای باندی جایگاه GH-2 ماهی سفید پس از توالی‌یابی 47
4-7 برآورد مقدار وفور ژنی و ژنوتیپی جایگاه GH-2 ماهی سفید 48
فصل پنجم 50
بحث و نتیجه گیری 50
5-1 بحث و نتیجه گیری 51
5-2 پیشنهادات 53
منابع 54
پیوست‌ها: 60

فهرست اشکال و جداول و نمودارها

شکل 2-1 ماهی سفید 8
شکل 2-2 کپور معمولی 9
شکل 3-1 دستگاه الکتروفورز افقی 25
جدول 3-1 اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری 26
جدول 3-2 مواد استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 27
شکل 3-2 دستگاه ترموسایکلر 27
جدول 3-3 توالی آغازگر اختصاصی برای جایگاه GH 28
جدول 3-4 دماهای استفاده شده در سیکل‌های PCR (درجه سانتی‌گراد) 29
جدول 3-5 زمان‌ها و تعداد سیکل‌های استفاده شده در PCR 29
جدول 3-6 مواد لازم جهت تهیه بافر بارگیری SSCP 30
جدول 3-7 مواد لازم برای تهیه 65 میلی لیتر ژل اکریل آمید 31
جدول 3- 8 مواد لازم جهت تهیه محلول ثابت کننده 32
جدول 3-9 مواد لازم جهت تهیه محلول رنگ‌آمیزی 32
جدول 3-10 مواد لازم جهت تهیه محلول ظاهرسازی 33
شکل 4-1 نمونه‌های از DNA استخراج شده به روش نمکی بهینه یافته 37
شکل 4-2 محصولات PCR یک قطعه از ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و اگزون 5 برای ژن GH-2 در ماهی سفید 37
شکل 4-3 محصولات PCR یک قطعه از ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و اگزون 5 برای ژن GH-2 در ماهی کپور معمولی 38
شکل 4-4 نمونه‌ای از باندهای SSCP ژن GH-2 ماهی سفید 38
جدول 4-1 فراوانی الگوهای باندی مشاهده شده در نمونه‌های مطالعه شده 39
جدول 4-2 بررسی فاکتور وضعیت ژنوتیپ های مشاهده شده در ماهی سفید 39
جدول 4-3 جدول ANOVA و آنالیز آماری GLM برای ماهی سفید 39
جدول 4-4 نتایج مقایسه میانگین حداقل مربعات الگوهای باندی مختلف برای صفت فاکتور وضعیت ماهی سفید 40
شکل 4-5 هشت الگوی باندی مشاهده شده در جایگاه ژن GH-1 ماهی کپور معمولی 40
جدول 4-5. فراوانی‌های ژنوتیپی جایگاه ژنی GH-1 مشاهده در 150 نمونه ماهی کپور مطالعه شده 40
جدول 4-6 بررسی فاکتور وضعیت ژنوتیپ های مشاهده شده در ماهی کپور معمولی 41
جدول 4-7 جدول ANOVA و آنالیز آماری GLM برای ماهی کپور معمولی 41
جدول 4-8 نتایج مقایسه میانگین حداقل مربعات الگوهای باندی مختلف ژن GH-1 برای صفت وزن ماهی کپور معمولی 42
شکل 4-6 مقابسه توالی‌ها بین نمونه‌های ماهی سفید با ژنوتیپ دارای الگوهای باندی A، B و C 43
شکل 4-7 هم ترازی سه نمونه ارسال شده ماهی سفید برای توالی یابی. 44
نمودار 4-1 نتایج حاصل از توالی‌یابی ماهی سفید 47
نمودار 4-2 هتروزیگوتی الگوی باندی A و C. 48
جدول 4-9 فراوانی ژنوتیپ‌های مشاهده شده و مورد انتظار در جایگاه GH-2 ماهی سفید 48
جدول 4-10 فراوانی ژنوتیپی و آللی جایگاه GH-2 ماهی سفید 49

راهنمای خرید و دانلود فایل

برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.

بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.

در صورت بروز  هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما  پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.

برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود  کلیک نمایید.