کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی علوم باغبانی

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان” کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها ” با گرایش علوم باغبانی  و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده پایان نامه کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها:

میخک یکی از محبوب ترین، اقتصادی ترین و مهم ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی و رقم های چند رنگ و منحصر به فرد می باشد. محدودیت های موجود در روش های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای – مولکولی برای بهبود ویژگی های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. اين پژوهش به منظور بررسي ريزافزايي ارقام استاندارد ’ ‘Rendz-Vousو مینیاتور’Panamera‘ توسط اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی، تعیین غلظت بهینه ماده گزینشگر کانامیسین و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها انجام شد.

بدین منظور آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به طور کامل تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این پژوهش، از قطعه های برگ گیاهان رشد یافته در گلخانه با سن 6 تا 8 هفته و پینه برای تهیه ریزنمونه استفاده گردید. انتقال ژن gus به میخک توسط سویه LBA 4404 باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید pBI121 بيان كننده ژن بتاگلوكورونيداز انجام شد. نتایج اندام زایی مستقیم  نشان داد که میانگین تعداد شاخساره های نابجا برای هر دو رقم با افزایش غلظت BA به 9/0 میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که با NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت 3/0 میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد. ارزیابی تأثیر شرایط تاریکی و روشنایی بر باززایی ارقام توسط رویان زایی بدنی در مدت زمان های 30 و 60 روز نشان داد که در شرایط تاریکی مقدار پینه به دست آمده برای هر دو رقم به طور معنی داری بیش از شرایط روشنایی می باشد.

نتايج تشکيل پينه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘ بيش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کاناميسين مقاوم است. به نظر مي رسد آلودگي باکتريايي تشکيل پينه و شاخساره را به عقب مي اندازد. بدون آلودگي باکتريايي تشکيل شاخساره در غلظت 50 ميلي گرم در ليتر کاناميسين براي رقم ’Rendz-Vous‘ به طور کامل متوقف شد در حالي که براي رقم ’Panamera‘ اين اتفاق در غلظت 100 ميلي گرم در ليتر کاناميسين صورت گرفت. در بهینه سازی انتقال ژن با اگروباکتریوم تأثیر غلظت باکتری، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون شیمیایی- بافتی و تجزیه PCR پیوستن ژن بتاگلوکورونیداز در شاخساره های تراریخت باززایی شده را اثبات نمود. چگالی نوری 5/0، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری به مدت 20 دقیقه و هم کشتی به مدت 3 روز سبب افزایش درصد شاخساره های تراریخت گردید. در این پژوهش رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ نسبت به رقم مینیاتور ’Panamera‘ کارایی انتقال ژن بالاتری نشان داد. اختلاف بین دو رقم در میزان باززایی و کارایی تراریزش به دلیل اندازه کوچکتر ریزنمونه های برگ در رقم مینیاتور ’Panamera‘ قابل توجیه است. گیاهک های باززایی شده از اندام زایی مستقیم، رویان زایی بدنی و تراریزش با اگروباکتریوم در آمیخته پرلایت و ورمیکولیت در شرایط رطوبت نسبی %95 نگهداری و سپس به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش انتقال ژن به میخک در ایران می باشد.

مقدمه پایان نامه کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها:

گل هديه‌اي است به بشر از جانب خالق هستي و موهبتي است براي تعالي روان، انديشه و خرد انسان. اگر نگاهي به تمدن چندين هزار ساله ايران داشته باشيم، نقش داريوش بزرگ در مجموعه تخت‌ جمشيد كه يك دسته گل در دست دارد نشان‌دهنده اين است كه فرهنگ مصرف گل از سال‌هاي دور در بين ايراني‌ها مرسوم بوده است.

ميخك[1] بيش از ٢٠٠٠ سال است كه به دست بشر كاشته مي‌شود. اين گل يكي از مهم‌ترين محصولات گلكاري دنيا مي‌باشد كه هم به جهت زيبايي و گوناگوني رنگ و هم از نظر اقتصادي از اهميت قابل توجهي برخوردار است (لارسون، 1375؛ Burich, 1996). در ايران كشت و كار ميخك از سال‌ها پيش متداول بوده است و در حال حاضر براي توليد گل بريدني در سطح وسيع كشت مي‌شود (خليقي، 1380).

كوشش‌هاي وسيعي در سراسر جهان براي بهبود كميت و كيفيت ميخك در جريان است. امروزه اهداف بهنژادي آن شامل: افزايش دامنه رنگ گل‌ها، معرفي شكل‌هاي جديد گل‌ها، افزايش تحمل به نور كم و دامنه وسيع‌تر دما، بهبود شاخه‌دهي در انواع مينياتور، افزايش پراكندگي توليد، طولاني كردن عمر پس از برداشت، قوي كردن ساقه، مقاومت به حشرات و بيماري‌ها و افزايش عطر آن مي‌باشد (Bunt and Cockshull, 1985)

اهميت و اهداف پژوهش کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها:

ميخك يكي از محبوب‌ترين، اقتصادي‌ترين و مهم‌ترين گل های بريدني به سبب پیوسته گلدهي (Mii, 1994) و رقم‌هاي چند رنگ و منحصر به فرد است (Dole and wilkins, 2005؛ Burich et al, 1996). اين گياه يكي از محصولات با ارزش براي صنعت گل بريدني بوده و تقاضا براي ارقام جديد و بهبود يافته آن رو به افزايش است. به هر حال، تراريختي ژنتيكي ميخك به تازگي به دليل كمبود يك تكنيك معمول كارا محدود شده است.

محدوديت‌هاي موجود در روش‌هاي بهنژادي سنتي (تلاقي و گزينش) و داشتن ويژگي‌هاي هتروزيگوسیتي[1] بالا در اين گياه سبب شده است كه كاربرد فنون جديد یاخته ای- مولكولي برای بهبود ويژگي‌هاي اقتصادي اين گياه ضرورت پيدا كند. كاربردي شدن فنون مولكولي خود نيازمند گسترش روش‌هاي مختلف كشت بافت[2] است. به طور معمول يك يا چند ويروس، باكتري و يا قارچ قلمه‌هاي ساقه اين گياه را آلوده مي‌كنند (لارسون، 1375). همچنین از دیگر مشکلات میخک می توان به از بین رفتن تعداد زیادی از قلمه های این گیاه در حین افزایش اشاره کرد.

برخي از روش‌هاي كشت بافت و ريز افزايی[3] مي‌توانند مشكلات ناشي از ويروس، باكتري و ساير عوامل بيماري‌زا را برطرف ساخته و در توليد انبوه گياهان يك شكل، عاري از بيماري و مناسب صدور به كشورهاي اطراف به ما كمك ‌نمايند. همچنين از كشت بافت مي‌توان به عنوان ابزاري برای انتقال ژن استفاده نمود و ويژگي‌هاي مطلوبي را گزينش و به گياه منتقل كرد. در محصولات گلکاری انتقال ژن های گزارشگر مانند GUS با استفاده از Agrobacterium tumefaciens در داوودی، میخک(Lu et al, 1991) و ورد (Firoozabady et al, 1991) به دست آمده است. این بررسی ها ممکن است مدل های مفیدی زمانی که ژن های مطلوب به جای ژن های گزارشگر یا نشانگر گزینشگر به درون گیاهان هدف انتقال می یابند، ارائه دهد (Stachel et al, 1986). اين پژوهش به منظور انجام كشت بافت دو رقم استاندارد و مينياتور ميخك و ارزيابي شرايط بهينه انتقال ژن با استفاده از tumefaciens Agrobacterium  به آن ها صورت گرفته است.

فهرست مطالب پایان نامه کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها:

• فصل اول: مقدمه. 2
• 1-1- منشاء 3
• 1-2- اصطلاح‌شناسي. 4
• 1-3- انواع ميخك.. 4
• ١-4- گياه‌شناسي و ريخت‌شناسي ميخك.. 5
• ١-5- روش‌هاي افزايش ميخك.. 7
• 1-6- اهميت و اهداف پژوهش… 7
• فصل دوم: مروري بر پژوهش هاي پيشين.. 10
• 2-1- ريزافزايي و کشت بافت ميخک.. 10
• 2-1-1- گزينش ريزنمونه و گندزدايي سطحي آن. 10
• 2-1-2- ريخت زايي و باززايي. 12
• 2-1-3- رويان زايي بدني. 13
• 2-1-3-1- تنظيم کننده هاي رشد. 14
• 2-1-3-2- محيط پينه زايي. 16
• 2-1-3-3- محيط ريشه زايي. 17
• 2-1-3-4- سن مواد گياهي و شرايط كاشت.. 18
• 2-1-4- مسيرهاي رويان زايي بدني. 19
• 2-2- انتقال ژن توسط اگروباكتريوم. 19
• 2-2-1- اساس ايجاد گال و پلاسميد Ti 20
• 2-2-2- انتقال T– DNA.. 20
• 2-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباكتريوم. 22
• 2-2-3-1- نژادگان (ژنوتيپ) 22
• 2-2-3-1-1- ريزنمونه هاي شروع كننده 22
• 2-2-3-1-2- سويه باكتري. 24
• 2-2-3-1-3- چگالي نوري. 25
• 2-2-3-1-4- انگيزاننده هاي ژن هاي بيماري زا 26
• 2-2-3-1-5- مدت زمان هم كشتي. 27
• 2-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین. 28
• فصل سوم: مواد و روش‌ها 30
• 3-1- كشت بافت.. 30
• 3-١-1- مواد گياهي. 30
• 3-١-2- قسمت‌هاي گياهي مورد استفاده در كشت بافت.. 30
• 3-١-٣- گندزدايي ريزنمونه‌ها و وسايل. 31
• 3-١-4- آماده‌سازي ريزنمونه‌ها برای استقرار 32
• 3-١-5- محيط كشت.. 32
• 3-2- انتقال توسط اگروباکتریوم. 34
• 3-2-1- مواد 34
• 3-2-1-1- بافر STET. 34
• 3-2-1-2- بافر الكتروفورز 34
• 3-2-1-3- بافر CTAB.. 35
• 3-2-1-4- بافر TE. 35
• 3-2-1- 5- بافر سنجش GUS. 35
• 3-2-1-6- بافر بارگذاری. 35
• 3-2-1-7- محلول ذخيره آنتي بيوتيك كاناميسين. 36
• 3-2-1-8- محلول ذخيره آنتي بيوتيك ريفامپيسين. 36
• 3-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم. 36
• 3-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون. 36
• 3-2-1-11- محلول ذخیره  نفتالن استیک اسید. 37
• 3-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین. 37
• 3-2-1-13- محيط كشت LB (Luria–Bertani) 37
• 3-2-1-14- سويه A. tumefaciens. 37
• 3-3- روش ها 38
• 3-3-1- تهیه ریزنمونه. 38
• 3-3-2- تهيه محيط هاي كشت بافت گياهي. 38
• 3-3-3- آغازگرها 40
• 3-4- روش ها 40
• 3-4-1- آماده سازي باكتري براي انجام انتقال ژن به ريزنمونه ها 40
• 3-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب.. 41
• 3-4-3- آماده سازي ريزنمونه ها و اگروباكتريوم برای انتقال ژن به میخک.. 42
• 3-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها 43
• 3-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه 43
• 3-4-6- گزینش و باززايي گياهان تراریخت.. 44
• 3-4-7- استخراج DNA  از بافت هاي گياهي با استفاده از محلول CTAB.. 45
• 3-4-9- روش کار 47
• 3-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR.. 49
• 3-4-11- تهيه ژل آگارز و انجام الکتروفورز براي بررسي نتايج آزمون PCR.. 51
• 3-4-12- آزمون شيميايي- بافتي برای تعيين فعاليت تراریخت GUS در شاخسارههاي تراریخت   51
• 3-4-13- واکاوی داده ها 52
•  فصل چهارم:  نتايج و بحث.. 54
• 4-1- کشت بافت.. 54
• 4-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک.. 54
• 4-1-1-1- مواد گیاهی. 54
• 4-1-1-2- گندزدایی. 54
• 4-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی. 55
• 4-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم. 56
• 4-2-1- آزمايش مقدماتي. 58
• 4-2-1-1- گزينش با کاناميسين. 58
• 4-2-2- توليد گياهان تراریخت.. 61
• 4-2-3- تأييد گياهان تراریخت با سنجش فعاليت GUS. 63
• 4-3- آناليز PCR.. 64
• 4-4- تأثير غلظت باکتري. 67
• 4-5- تاثير زمان مايه زني. 71
• 4-6- تاثير مدت زمان هم کشتي بر کارايي انتقال ژن. 69
• 4-7- برهمكنش سه عامل چگالي نوري باکتري، مدت زمان مايه زني ريزنمونه ها با باکتري و مدت زمان هم کشتي  73
• پيشنهادها 77
• منابع. 78

فهرست جدول­ ها

• جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلول­هاي پايه محيط كشت MS. 34
• جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد استفاده. 40
• جدول 3-3- مواد مورد نياز براي استخراج DNA  ژنومی 47
• جدول 4-3-  مواد لازم در واكنش PCR. 51
• جدول 5-3- دوره های دمایی واکنش های PCR. 51
• جدول 1-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ رقم  استاندارد’Rendz-Vous‘ . 57
• جدول 2-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریز نمونه های برگ رقم ’Panamera‘. 57
• جدول 3-4- اندام زايي از ريزنمونه هاي برگ دو رقم ميخک روي محيط داراي کاناميسين با و بدون آلودگي توسط Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. 60
• جدول4-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در تیمار چگالی های نوری مختلف باکتری. 70
• جدول 5-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در مدت زمان های مايه زني ریز نمونه ها با باکتری. 71
• جدول6-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در مدت زمان های هم کشتی مختلف ریز نمونه ها با باکتری. 74
• جدول 7-4- مقایسه درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مايه زني با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Rendz-Vous‘ 76
• جدول 8-4- مقایسه درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مايه زني با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم  ’Panamera‛ 77

فهرست نگاره­ ها

نگاره1-3. جايگاه هاي برشي پلاسميد pBI121. 43

نگاره1-4- ایجاد شاخساره و پینه پس از گذشت 8 تا 10 هفته از مایه کوبی برای رقم
Rendz–Vous 63

نگاره 2-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Rendz–Vous‘ 64

نگاره 3-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Panamera‘ 65

نگاره 4-4- نتایج آزمون PCR در رقم  ’Rendz–Vous‘. وجود گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن GUS برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 7 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 8 و 9  مربوط به گیاهان ناتراریخت……. 66

نگاره 5-4- نتایج آزمون PCR در رقم ‘Panamera‘. گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن gus برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 4 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 5 تا 7  مربوط به گیاهان ناتراریخت.. 67

نگاره 6-4- سنجش ژن GUS در ریزنمونه های پینه (A,B,C) و اندام های گل (D) باززایی شده در رقم ‘Rendz–Vous‘ 68

کوتاهه ­ها

راهنمای خرید و دانلود فایل

برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.

بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.

در صورت بروز  هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما  پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.

برای دانلود فابل روی دکمه خرید و دانلود  کلیک نمایید.